组蛋白甲基转移酶2(SMYD2)抑制剂LLY-507对成骨分化的影响

李建良 张濛 麦嘉乐 何琪 张罡瑜 陈伟坚 肖嘉聪 潘兆丰 宫大伟,4 王海彬,5*

1. 广州中医药大学，广东 广州 510405

2. 广州中医药大学岭南医学研究中心中医骨伤科实验室，广东 广州 510405

3. 河南省人民医院，郑州大学人民医院，河南大学人民医院骨科, 河南 郑州 450003

4.山东省文登整骨医院，山东 威海 264400

5. 广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

骨质疏松症( osteoporosis，OP)作为目前一种影响众多老年人口以及包括绝经后妇女在内的重要疾病之一，是以骨骼强度变低、骨小梁微结构发生破坏、骨质脆性增加为特点，最终容易引发骨质疏松性骨折和疼痛，严重影响患者的生活质量的一种疾病[1-2]。针对骨质疏松症的治疗是医疗界的一大难题，新型靶向药物的研发及应用是目前医疗界研究的重点。因此，针对骨质疏松新靶点的研究是目前研究热点之一。

骨质疏松的发生发展，根本原因在于骨稳态的破坏，具体表现为成骨细胞分化受到抑制，破骨细胞分化活动进一步加强。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，具有负责新骨形成的功能。在成骨分化这一重要的过程中，其基本的生物学特征包括骨小梁基本单位——骨基质合成、分泌、矿化及成熟。成骨细胞首先合成I型胶原(collagen-I, COL-I)、骨钙素(osteocalcin, OC)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)等胞外基质，并通过基质小泡释放钙离子和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)等酶类物质，钙离子在碱性磷酸酶作用下沉淀在胶原纤维丝上，完成基质矿化过程，最终形成骨组织。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志物，骨基质合成期开始出现，矿化期达巅峰；矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志，同时也是成骨细胞行使成骨功能的主要形态学特征，观察成骨细胞的矿化结节是研究成骨细胞分化的常用技术方法之一。

组蛋白甲基化转移酶2(SET and MYND domain containing protein 2，SMYD2)基因位于1号染色体GRCh38.p13，属于组蛋白甲基转移酶SMYD家族。SMYD2是一种含有SET结构域的组蛋白甲基化转移酶。SMYD2在正常组织、肿瘤组织中分布广泛。SMYD2的转录产物在心、脑、肝、肾、卵巢和骨骼肌等部位高表达，对维持骨骼肌的功能和结构有着重要的意义[4]。SMYD2作用蛋白广泛，不仅可以甲基化组蛋白，而且还可以甲基化非组蛋白，如p23和Hsp90[5-6]。目前有相关的文献[4,7-12]表明，SMYD2蛋白的过度表达与肿瘤增殖、肿瘤浸润、淋巴管侵袭、淋巴结转移等因素密切相关，是癌症预后不良的一个重要因素。但SMYD2在肿瘤细胞中的具体作用机制尚未完全阐明。LLY-507是目前针对SMYD2的新型抑制剂，能有效地抑制SMYD2对p53肽段和对H4的甲基化。LLY-507对SMYD2的选择性比对其他蛋白或DNA甲基转移酶(包括相关的家族成员SMYD3, SUVH420H1, SUV420H2)高100倍[13]。LLY-507能使多种激酶、蛋白偶联受体以及细胞核激素受体失活。LLY-507以剂量依赖方式抑制食管、肝脏、乳腺癌细胞株的增殖[14]。但目前SMYD2及其抑制剂LLY-507在骨质疏松领域及细胞株的应用尚未有相关文献报导。本研究通过先期对hMSCs进行成骨诱导，分别取第3天、第7天、第14天收取RNA样品进行高通量测序，发现SMYD2在成骨诱导过程中变化较大，且在成骨过程中呈现高表达，相应测序后FPKM值见结果图1B。本研究首次通过对小鼠前成骨细胞及hMSCs应用SMYD2抑制剂LLY-507干预，观察对其成骨分化能力的影响，揭示了SMYD2对其维持成骨分化具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要材料、试剂和仪器：小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1)细胞系和hMSCs(hMSCs)分别购自武汉普诺赛生命科技有限公司和赛业公司；组蛋白甲基转移酶SMYD2抑制剂LLY-507(Selleck，美国)，分子量：574.76，分子式：CHNO，分子结构式见图1A；α-MEM培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；0.5%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，美国)；青霉素/链霉素(Gibco，美国)；地塞米松(Sgima-Alrich，美国)；抗坏血酸(Sgima-Alrich，美国)；β-甘油磷酸钠(Sgima-Alrich，美国)；CCK-8试剂盒(碧云天，上海)；碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天，上海)；碱性磷酸酶活性测定试剂盒(碧云天，上海)；0.2%茜素红S染色液(赛业，美国)；氯化十六烷基吡啶(Sgima-Alrich，美国)；PCR引物(生工，上海)；荧光定量PCR试剂盒(Takara，日本)；Trizol(Takara，日本)；PrimeScrpitTMRT Master Mix(Takara，日本)；SYBR,RPremix EX TaqTM(Takara,日本)。

1.1.2细胞培养与分组：MC3T3-E1和hMSCs细胞在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中采用含有10%胎 血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL链霉素的α-MEM培养基进行培养，每3天换液1次，细胞密度约为80%时进行传代。细胞分组：细胞分为阴性对照组(CON)、阳性对照组(OIM)、25、50、100 nmol/L LLY-507的干预组。

1.2 方法

1.2.1细胞增殖测定：CCK-8细胞增殖试验：取生长状态良好的MC3T3-E1细胞和hMSCs，以每孔150 μL培养基以5 000个细胞密度种于96孔板中，每个实验组设置6个复孔；24 h后加药干预，96，h后，每孔加入10 μL的CCK-8检测液，37 ℃孵育2 h，用酶标仪检测OD 450 nm的吸光值并计算细胞存活率。

1.2.2碱性磷酸酶染色及活性检测细胞成骨分化能力：将第5～7代的MC3T3-E1和hMSCs以2×104/孔密度接种于24孔板中，培养24 h待细胞贴壁、形态稳定后，阴性对照组加入普通完全培养基，阳性对照组加入不含LLY-507的成骨诱导培养基(β-sodium glycerophosphate 10 mmol/L、Vitamin C 50 μg/mL、Dexamethasone 100 nmol/L)；将LLY-507干预组培养液更换为含有25、50、100 nmol/L不同浓度的LLY-507的成骨诱导培养基；培养基每48 h更换1次。于培养第7天进行染色及活性检测，吸走培养基后，PBS冲洗两遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，去除固定液，PBS冲洗1次，按照说明书配制碱性磷酸酶染色工作液，染色1 h，除去工作液，加入PBS终止反应，显微镜下拍照。每孔加入50 μL的Ripa裂解液裂解细胞，离心后收集上清液作为样品。按照说明书配制标准品及活性测定工作液，充分震荡混匀后，96孔板中每孔加入50 μL底物、30 μL缓冲液和20 μL样品，总体积共100 μL，每组设置3个复孔。37 ℃孵育15 min，酶标仪检测405 nm处的吸光度值，根据吸光度值绘制ALP活性酶测定标准曲线，单位为二乙醇胺(diethanolamine, DEA)酶活力单位。

1.2.3茜素红染色及半定量测定检测细胞矿化能力：细胞接种和培养方法同上，连续培养14 d，染色步骤中用茜素红染液染色，余同ALP染色，染30 min，超纯水洗涤后显微镜下拍照；然后在每孔中加入200 μL 10%氯化十六烷基吡啶于37 ℃孵箱内充分溶解30 min，取10 μL的洗脱液加入含有40 μL PBS的96孔板中，在562 nm测定吸光度，进行半定量检测。

1.2.4qPCR检测hMSCs成骨相关基因表达：提取细胞总RNA后进行浓度以及纯度检测，采用Takara试剂盒进行反转录，合成cDNA。于95 ℃预变性30 min，同温度下变性5 s，于60 ℃退火30 s，在72 ℃延伸30 s，反复扩增40个循环。采用GAPDH作为内参进行定量分析，每组设置3个复孔，引物序列见表1。待RT-PCR反应结束后，分析其扩增曲线和熔解曲线，对结果采用2-ΔΔCt进行统计分析。

表1 引物序列Table 1 Primers for quantitative real-Time PCR

1.2.5Western blot检测hMSCs成骨相关蛋白的表达：取不同时间点干预后的细胞，Ripa裂解液冰上裂解30 min，细胞刮下，离心，取上清，BCA法测定蛋白浓度，加入相应体积的5× loading buffer煮蛋白10 min；将蛋白样品按要求加入SDS-PAGE 凝胶中，100 V 60 min进行电泳，230 mA 120 min转膜，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，去掉封闭液后，加入足量TBST洗膜，每次10 min，洗3次。加入一抗4 ℃过夜孵育，加入足量TBST 洗膜，每次10 min，洗3次。加入对应的二抗，室温下孵育1 h，加入足量的TBST洗膜3 次，每次10 min,洗3次。配制ECL发光液，用显影仪显影曝光。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 LLY-507对MC3T3-E1和hMSCs细胞增殖的影响

分别使用不同浓度的LLY-507处理MC3T3-E1和hMSCs细胞96 h，与对照组相比，当药物浓度在800 nmol/L以下时，MC3T3-E1和hMSCs细胞活性无明显影响，当药物浓度为1.6 μmol/L时，MC3T3-E1和hMSCs细胞活力显著降低，细胞增殖受到抑制(见图2A、2B)。

2.2 LLY-507抑制MC3T3-E1和hMSCs细胞的成骨矿化能力

使用不同浓度的LLY-507处理MC3T3-E1和hMSCs细胞7 d后进行ALP染色，结果表明，LLY-507处理组ALP染色明显浅于对照组，且呈现一定的剂量依赖性；第7天的ALP活性测性测定结果与ALP染色结果相一致。表明LLY-507能够抑制MC3T3-E1和hMSCs细胞的早期成骨分化。第14天的茜素红染色结果显示，LLY-507处理组茜素红染色明显浅于对照组，说明LLY-507能够明显抑制MC3T3-E1和hMSCs钙结节的形成，表明LLY-507能够抑制MC3T3-E1和hMSCs细胞的矿化(P<0.05)。见图3。

2.3 qPCR检测LLY-507对成骨分化相关基因的表达

结果表明LLY-507对抑制成骨基因表达呈现一定剂量梯度依赖性。加入100 nmol/L的LLY-507干预7 d后能够明显抑制hMSCs和MC3T3-E1成骨分化相关基因Runx2、Osterix、OPG、OPN的mRNA表达(P<0.05)。干预14 d后，结果表明加入50、100 nmol/L剂量的LLY-507能够明显抑制hMSCs和MC3T3-E1成骨分化相关基因Runx2、Osterix、OPG、OPN的mRNA表达(P<0.05)。见图4。

2.4 Western Blot检测LLY-507对hMSCs的Runx2和SMYD2蛋白的表达

结果表明加入LLY-507干预7 d和14 d后均能够明显抑制hMSCs的Runx2蛋白的表达，同时LLY-507作为SMYD2的抑制剂，能够有效抑制SMYD2蛋白的表达，从而证实了LLY-507是SMYD2的高效抑制剂，同时也说明SMYD2在成骨分化过程中起着重要作用。见图5。

3 讨论

骨形成与骨吸收的动态平衡是维持骨稳态的重要因素。当骨吸收能力高于骨形成的能力时，骨稳态的平衡被打破，诱发骨质疏松症[15]。MSCs是一种多能细胞，具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞多向分化的能力。而成骨分化为成骨细胞是骨生长和重建过程的重要组成部分[16]。hMSCs已被广泛用作骨组织工程的成骨细胞来源[17]。目前已知成骨细胞通过OPG/RANKL和Fas/FasL途径影响破骨细胞的形成、分化或凋亡[18]。Osterix和Runx2是成骨分化关键的转录因子，能够上调碱性磷酸酶的表达，并促进钙盐的沉积及骨小梁的形成。碱性磷酸酶是成骨分化早期的关键标志物，可以促进相关成骨分化基因骨钙蛋白BGP表达。成骨分化的晚期，主要表现为骨细胞外基质形成，钙盐沉积在骨小梁的网状结构中[19-20]。本研究表明低浓度的LLY-507可以有效减少ALP及相关成骨分化因子的表达，从而进一步削弱成骨细胞的矿化及钙盐沉积活动，说明在成骨分化过程中SMYD2起促进作用。

破骨细胞的分化受到成骨细胞分泌的骨保护素(OPG)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)两种因子的影响。RANKL通过与核因子κB受体活化因子(RANK)的受体结合从而激活破骨细胞参与调节骨吸收的过程。而成骨细胞分泌的OPG可以阻断RANKL和RANK的结合，从而抑制破骨细胞的活性，维持骨稳态的动态平衡[21]。当骨质疏松症发生时，骨吸收增强、骨形成减弱，因此OPG是衡量骨稳态的一种重要指标[22]。为了进一步证实SMYD2在成骨分化过程中的作用，本研究通过qPCR和Western Blot检测了不同剂量LLY-507对hMSCs成骨分化标志物Runx2、Osterix、OPG、OPN基因的mRNA和Runx2、SMYD2蛋白的表达水平，发现LLY-507作为SMYD2抑制剂，在降低SMYD2表达后，可以显著抑制hMSCs成骨分化特异性基因的表达，从mRNA和蛋白表达水平说明SMYD2在成骨分化过程中的作用不可或缺。

相关文献[12,23]表明，SMYD2 在肾囊肿组织中呈高表达状态，其抑制剂AZ-505可以诱导SMYD2的小鼠囊肿内细胞凋亡，减轻囊肿组织生长速度。具体机制为SMYD2通过STAT3和NF-κB的p65亚基的甲基化和激活来发挥其功能使其磷酸化活化，促进囊性上皮细胞分泌多囊蛋白和炎性细胞因子，进而促进囊肿的生长。由此可见NF-κB信号通路参与了SMYD2的活化。而NF-κB信号通路与细胞的炎症、凋亡等表型变化密切相关。Li 等[24]在三阴性乳腺癌TNBC细胞系中发现，IL-6-STAT3和TNFα-NF-κB信号传导可上调SMYD2的表达，后者将表观遗传调控整合到TNBC细胞系的炎症中，并且确定了一个新的SMYD2转录靶基因PTPN13，可将SMYD2连接到由PTPN13介导的磷酸化作用的ERK、mTOR和Akt信号通路中。说明SMYD2可能是NF-κB信号通路和PI3K的一个重要的交互(crosstalk)节点。既往SMYD2在骨质疏松领域的具体功能尚未有报导，本研究通过应用SMYD2的抑制剂LLY-507对体外细胞MC3T3-E1和hMSCs的实验表明，SMYD2抑制剂LLY-507在低浓度下即可以作用于抑制成骨分化。本研究首次证实SMYD2能够维持hMSCs向成骨方面分化。但其SMYD2在抗骨质疏松领域体内实验和具体作用靶点以及相关的分子作用机制，需要进一步深入研究。