龙胆苦苷通过MAPK信号通路对骨质疏松大鼠骨吸收的影响

王维学 陈希跃 丰景斌 罗贤红 符仲秋

海南省三亚市人民医院创伤骨科，海南 三亚 572000

骨质疏松(osteoporosis, OP)是一种骨代谢疾病，尤其是绝经后的女性，雌激素水平突然降低会引起骨代谢紊乱，增加骨折的风险[1]。雌激素、雌激素受体调节剂、降钙素和双膦盐是目前用于治疗骨质流失的药物，但它们增加了患乳腺癌、血栓栓塞性疾病和非典型股骨骨折的潜在风险[2-3]。因此，迫切需要发现更有效、更安全的OP治疗药物。

研究认为，炎症反应与OP有直接关系[4]。阻断炎症反应已经成为防治OP的重要途径[5]。龙胆苦苷(gentiopicroside, GENT)具有抗炎活性，可通过核因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信号通路，降低白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素6(interleukin 6, IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)水平，防止脂多糖引起的败血症[6]；并且可通过JNK和NF-κB信号通路的失活抑制核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κ B ligand, RANKL)诱导的破骨细胞生成[7]。故GENT可能是治疗OP的有前途的药物。但是，尚缺乏足够的实验验证。因此，本研究旨在探讨GENT对骨质疏松大鼠骨吸收的影响及可能的作用机制，为GENT治疗OP的应用及新药开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物

12周龄SPF级健康SD雌性大鼠78只，体重 210～230 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证为SCXK(京)2019-0009。将动物在受控的环境条件(环境温度24±2 ℃，湿度55%±5%，光照12 h/黑暗12 h)下饲养，自由饮水和摄食。研究已由机构动物护理和使用委员会批准(批号：19010004-2)，并遵循《实验动物的护理和使用指南》。

1.2 主要试剂及仪器

龙胆苦苷(L-005)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；大鼠核心结合因子α1(corebindingfactorα1, CBF-α1)(K24504)、Ⅰ型胶原交联羧基末端肽(cross-linked carboxy-terminal telopeptide of type Ⅰ collagen, CTX-Ⅰ)(ARB11951)ELISA检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司；Ⅰ型前胶原氨基端原肽(procollagen I N-terminal peptide, PINP)(mL038224)、骨钙素(osteocalcin, OC)(mL002883)、雌二醇(estradiol, E2)(mL002871)、IL-6(mL102828)、TNF-α(mL002859)、IL-1β(mL037361)ELISA检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；HE染色试剂(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)、BCA试剂盒(P0010)购自碧云天生物科技公司；抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色试剂盒(PMC-AK04F-COS)购自日本COSMO公司；小鼠抗大鼠RANKL(ab239607)、山羊抗小鼠IgG H&L(HRP)(ab205719)、兔抗大鼠JNK(ab76125)、p-JNK(ab124956)、ERK1/2(ab184699)、p-ERK1/2(ab214362)、p38 MAPK(ab170099)、p-p38 MAPK(ab47363)、β-actin(ab8227)、山羊抗兔IgG H&L(HRP)(ab205718)购自英国Abcam公司。

双能X射线吸收测定仪(动物身体成分及骨密度测定仪)购自北京拜安吉科技有限公司；微型计算机断层扫描技术(Micro CT)购自德国Siemens AG公司；万能材料试验机(INSTRON)购自美国INSTRON；多功能酶标仪(iMark680)、蛋白转膜装置购自美国Bio-Rad公司；电子显微镜(BX61)购自日本Olympus公司。

1.3 模型制备、分组及给药

大鼠适应性饲养3 d后开始实验，随机选取12只大鼠为假手术组(Sham组)，其余大鼠参考文献[8-9]方法采用去卵巢法构建OP模型。所有大鼠术前禁食12 h，戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后以俯卧位固定，背部脱毛，碘伏消毒，脊柱两侧分别作一约1 cm左右的纵行切口，分离皮下组织和肌肉，切开腹膜进入腹腔，找到卵巢及输卵管，在距卵巢5 mm处结扎输卵管，切除卵巢，逐层缝合腹膜和皮肤，碘伏消毒，肌肉注射青霉素预防感染。假手术组麻醉后采取相同的操作进入腹腔，找到卵巢，除不进行卵巢切除外，其余操作同上。术后饲养12周，双能X射线吸收测定骨密度(BMD)水平；并随机选取6只大鼠进行HE染色，以BMD明显降低、骨小梁微结构受损严重判定模型构建成功。将造模成功的60只大鼠随机分为模型组(OP组)、雌二醇组(E2组，0.0 5 mg/kg)[8]、龙胆苦苷低(GENT LD，30 mg/kg)、中(GENT MD，60 mg/kg)、高剂量组(GENT HD组，120 mg/kg)[10]，每组12只。第13周开始灌胃给药，雌二醇组和龙胆苦苷各剂量组灌胃给予相应的药物，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，灌胃体积为1 mL/100 g，1次/d，连续给药12周。

1.4 取材及指标检测

1.4.1血清骨代谢标志物CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平检测：末次给药后，麻醉大鼠，腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，采用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清CBF-α1、CTXI、PINP、OC水平。具体操作为：取出试剂盒室温平衡30 min；在96孔板中设置标准品孔和样本孔，分别向各反应孔中加入50 μL的标准品、40 μL样本，样本中加入10 μL抗体，每孔再分别加入50 μL HRP标记的辣根过氧化物酶，封板膜封闭后在37 ℃孵育1 h，弃去液体、洗涤液重复洗5次，拍干；每孔加入50 μL A液和50 μL B液，37 ℃避光显色10 min，加入终止液50 μL，终止反应(蓝色转为黄色)；在酶标仪上检测各孔在450 nm波长处的吸光度值。根据标准品浓度和吸光度值作出标准曲线，根据标准曲线计算各样本的浓度。

1.4.2血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平检测：采用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平，严格按照试剂盒说明书的步骤操作，具体操作步骤同1.4.1。

1.4.3股骨机械强度的测量：分离各组大鼠右侧完整股骨，每组随机选取6只大鼠右侧股骨，通过三点弯曲测试评估右股骨机械强度。将样品放置在相距20 mm的两个支架上。选择5 mm/min的位移速率，在中点施加弯曲载荷，直到骨折。通过计算机数据采集系统以100 Hz的采样率收集载荷-位移数据。从载荷-位移曲线，获得最大载荷和断裂挠度。

1.4.4Micro-CT检测骨密度及骨小梁微结构参数：剩余6只大鼠右侧股骨，10%甲醛固定24 h后，保存在70%乙醇溶液中，使用Micro-CT影像系统对股骨远端进行扫描。图片经三维重组后，观察大鼠股骨远端骨微结构变化，分析骨小梁骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV，感兴趣区内骨组织体积除以总体积)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁间隔(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

1.4.5HE染色观察骨组织形态学变化：每组随机选取6只大鼠左侧股骨，剥离附着的肌肉组织，10%甲醛固定，加入10%乙二胺四乙酸二钠脱钙处理4～6周，常规处理并包埋在石蜡中。将样品切成5 μm切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水，蒸馏水冲洗，苏木精染色8 min，自来水冲去浮色，1%盐酸酒精分色，伊红染色5 min，自来水流水洗3次，至无色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察骨组织形态学变化。

1.4.6TRAP染色分析骨表面的破骨细胞数量：根据TRAP染色试剂盒的说明制备染色溶液。将石蜡包埋的切片进行脱蜡和水化处理，将其浸泡在37 ℃的预热染料液中，用蒸馏水洗涤，再次染色1 min。然后，将切片用梯度乙醇脱水，用二甲苯净化，并用中性树胶密封。显微镜下观察并拍摄图像，然后使用Image-Pro plus 6.0分析软件分析每个骨表面的破骨细胞数量(number of osteoclasts per bone surface, N.Oc/BS)。TRAP的阳性表达表现为在细胞质中出现亮红色或深红色颗粒。具有3个或3个以上核的TRAP阳性多核细胞被认为是破骨细胞。

1.4.7WesternBlot检测骨组织RANKL和MAPK通路相关蛋白的表达：剩余6只大鼠的左侧股骨，RIPA裂解液提取骨组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳，湿转法转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗(RANKL 按1∶500的比例稀释，p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、p-p38 MAPK、p38 MAPK 按1∶1 000的比例稀释)于4 ℃下孵育过夜，HRP标记的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL显色，以β-actin为内参，通过与内参的灰度比，得出目的条带的相对表达水平。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血清骨代谢标志物的含量比较

与Sham组相比，OP组大鼠血清CBF-α1、CTX-Ⅰ、PINP、OC水平均明显降低(P<0.05)；与OP组相比，E2组和GENT MD、GENT HD组血清上述指标明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清骨代谢标志物的含量比较Table 1 Comparison of serum bone metabolism markers between each

2.2 各组大鼠血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平比较

与Sham组相比，OP组大鼠血清E2水平显著降低，IL-6、TNF-α、IL-1β水平显著升高(P<0.05)；与OP组相比，E2组和GENT MD、GENT HD组大鼠血清E2水平明显升高，IL-6、TNF-α、IL-1β水平明显降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠血清E2、IL-6、TNF-α、IL-1β水平比较Table 2 Comparison of serum E2, IL-6, TNF-α, and IL-1β in rats between each

2.3 各组大鼠股骨机械强度的比较

与Sham组[(136.97±8.15)N，(1.59±0.11)mm] 大鼠股骨的最大负荷和断裂挠度相比，OP组[(93.77±9.46)N，(1.06±0.10)mm]显著降低(P<0.05)；与OP组大鼠股骨的最大负荷和断裂挠度相比相比，E2组[(118.46±10.21)N，(1.24±0.12)mm]和GENT MD[(109.33±9.82)N，(1.17±0.11)mm]、GENT HD组[(117.82±12.03)N，(1.23±0.07)mm]明显增加(P<0.05)。

2.4 各组大鼠骨密度及骨小梁微结构参数比较

与Sham组相比，OP组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th显著降低，Tb.Sp显著增大(P<0.05)；与OP组相比，E2组和GENT MD、GENT HD组大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th均明显升高，Tb.Sp明显降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠骨密度及骨小梁微结构参数比较Table 3 Comparison of bone mineral density and trabecular microstructure parameters of rats between each

2.5 各组大鼠骨组织形态的变化

HE染色结果显示，Sham组大鼠骨组织中可见骨小梁形态完整，结构清晰，排列整齐相互交织呈网状；与Sham组相比，OP组大鼠骨皮质厚度和骨小梁数量明显减少，且骨小梁出现断裂，排列疏松，孔隙变大；与OP组相比，E2组和GENT MD、GENT HD组可见新生骨小梁，数量有所增多，形态相对完整；见图1。

2.6 各组大鼠骨表面的破骨细胞数量

TRAP染色结果显示，与Sham组(19.80±2.51) 大鼠破骨细胞/骨表面的平均数量(N.Oc/BS)相比，OP组(42.65±3.08)显著增多(P<0.05)；与OP组大鼠破骨细胞/骨表面的平均数量(N.Oc/BS)相比，E2组(36.02±3.19)和GENT MD(30.93±2.67)、GENT HD组(37.51±2.84)大鼠N.Oc/BS明显降低(P<0.05)。见图2。

2.6 各组大鼠骨组织RANKL和MAPK通路相关蛋白的表达比较

与Sham组相比，OP组大鼠骨组织RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表达显著升高(P<0.05)；与OP组相比，E2组和GENT MD、GENT HD组大鼠RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表达明显降低(P<0.05)。见图3、表4。

表4 各组大鼠骨组织RANKL和MAPK通路相关蛋白的表达Table 4 Expression of RANKL and MAPK pathway related proteins in the bone tissue of rats in each

3 讨论

骨骼的重塑过程，是由骨形成细胞(成骨细胞)和骨吸收细胞(破骨细胞)介导[11]。绝经后的女性是患OP的主要人群[12]。雌激素缺乏会诱导破骨细胞分化所需的RANKL激活，它可以与破骨细胞膜上的核因子κB受体活化因子(RANK)结合并刺激NF-κB和MAPK途径用于破骨细胞的分化和形成，导致骨吸收增强[13-14]。手术摘除卵巢可以模拟临床上绝经后女性雌激素水平的降低，是制备OP动物模型的有效方法[15]，故本研究采用卵巢摘除术来构建OP大鼠模型。虽然雌激素类药物是临床治疗OP的一线药物，但由于其肝肠清除率高、吸收率低、不良反应大等，限制了其使用。因此筛选和研发新型、安全、有效的药物仍是临床和研究人员工作的重点。

有研究已证实天然产物靶向破骨细胞是治疗OP的重要方法，如大黄酸[13]、葛根素[16]、绞股蓝总皂苷[17]等。GENT具有多种药理活性，如抗炎[6]、抗氧化[18]、抗肿瘤[19]等；对软骨细胞也有一定的保护作用[20]。黄力鹏等[20]发现GENT通过抑制NF-κB信号通路，降低软骨组织中NO和TNF-α水平，减轻软骨退变，改善创伤性骨关节炎大鼠关节软骨的形态；Chen等[7]发现GENT可通过抑制JNK和NF-κB信号通路进而抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。表明GENT可能是治疗OP的潜在药物。本研究发现，卵巢摘除后大鼠血清E2水平显著降低，BMD明显降低、骨小梁微结构受损严重，提示模型构建成功。血液中CBF-α1、CTXI、PINP、OC水平能特异性地反映OP骨代谢平衡情况[8]。在本研究中，OP大鼠血清CBF-α1、CTXI、PINP、OC水平明显降低，三点弯曲结果也显示OP大鼠的最大负荷和断裂挠度显著降低，结合BMD和骨小梁的微结构受损，提示卵巢摘除后OP大鼠骨代谢失衡。GENT治疗后大鼠上述指标水平明显升高，骨组织可见新生骨小梁。骨密度并不能完全反映骨的强度，骨小梁的微结构变化是影响骨强度最重要的因素，骨小梁的微结构破坏增加，OP和骨折发生的风险也相应增加，显微CT能够很好的评价骨小梁微结构[21-22]；破骨细胞生成和骨吸收过多会导致骨小梁质量和微结构的变化，从而导致潜在的骨折风险。我们通过TRAP染色进一步分析每个骨表面的破骨细胞数量(N.Oc/BS)，结果显示GENT干预后大鼠骨小梁微结构参数BV/TV、Tb.N、Tb.Th明显增加，Tb.Sp和N.Oc/BS明显降低。以上研究提示GENT可能通过抑制破骨细胞的生成，有效改善OP大鼠的骨代谢失衡和骨微结构，且呈一定的剂量依赖性。

Li等[23]对OP患者的外周血单核细胞(PBM)进行微阵列研究，通过KEGG通路富集分析发现MAPK途径可能通过成骨细胞分化和骨形成参与OP。OP也被认为是一种慢性炎性疾病，因为包括TNF-α、IL-1β和IL-6在内的几种促炎细胞因子的增加会调节RANKL的表达[16]。RANKL诱导NF-κB和MAPK通路的激活是调节破骨细胞形成和成熟的主要信号通路。研究发现RANKL刺激后，磷酸化并激活了三种MAPK，即ERK、p38和JNK，抑制ERK1/2、p38 MAPK和JNK途径可有效抑制破骨细胞成熟和骨吸收[24-25]。GENT具有强大的抗炎活性，可通过抑制血清及滑膜组织IL-6、TNF-α水平，发挥对佐剂性关节炎大鼠的保护作用[10]；并且可通过抑制p38 MAPK/NF-κB途径在人成纤维样滑膜细胞中发挥抗风湿作用[26]；此外，还可通过抑制JNK和NF-κB信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞生成[7]。本研究发现，去卵巢后OP大鼠血清炎性相关因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著升高，同时骨组织RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表达升高，说明OP大鼠MAPK途径被激活；而GENT干预后，OP大鼠血清炎性相关因子水平降低，骨组织RANKL、p-JNK/JNK、p-ERK1/2/ERK1/2、p-p38/p38的表达也明显降低，提示GENT可降低RANKL的表达，抑制MAPK通路的激活。

综上所述，GENT可改善OP大鼠的骨微结构，对OP具有保护作用，其作用机制可能与抑制MAPK通路的激活，进而抑制破骨细胞的生成，减少骨吸收有关。GENT的局限性在于它在体内的清除率大约为3 h，这导致需要频繁给药以维持血药浓度[6]，因此，如何提高血药浓度并缓慢释放需要进一步研究。此外，尚需要体外细胞实验进一步验证GENT对MAPK通路的调控作用。