葛根素介导PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制绝经后骨质疏松症的机制研究

杨一秋 李兰 解继胜 陈建海 罗秀秀 毛宝玉 赵娜 周兰岛

1.右江民族医学院，广西 百色 533000

2.右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种常见的以骨量降低、骨微结构破坏为特征的代谢性骨骼疾病[1-2]。常见的骨质疏松症包括原发性和继发性。原发性骨质疏松症常发生在绝经后妇女，主要表现为破骨细胞活性升高而成骨细胞活性未升高，最终使得溶骨效应增强，从而出现骨质疏松症[3]。对于骨质疏松症的诊断和治疗已经有所好转但与糖尿病管理相比仍然不足，需要进一步的努力来改善[4]。目前公认的治疗方法是雌激素替代疗法(HRT)，但长期应用HTR会增加老年女性患子宫内膜癌、乳腺癌、血栓栓塞性疾病的风险[5]。葛根的主要活性成分之一葛根素可以改善心脑血管疾病、起到保护神经和预防治疗骨质疏松症的作用[6]。傅光涛等[7]研究发现12周是使用卵巢切除法建立雌性C57/BL6J成年小鼠绝经后骨质疏松模型的合适时机，这与我们之前的研究结果一致[8]。绝经后骨质疏松模型的成功建立，为本研究的顺利开展提供了很好的帮助。因此，本研究主要探讨葛根素对去卵巢小鼠骨组织形态的影响以及其可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

实验动物：10～12 周龄，体重约 20～25 g的雌性C57BL/6小鼠(SPF级)，购于长沙市天勤生物技术有限公司。所有实验用小鼠均符合相关动物伦理审批要求[SCXK(湘)2019-0014]，实验流程严格遵守动物实验中心的要求和使用指南。实验前购买的小鼠统一放在动物实验中心检疫室饲养7 d，然后转移到SPF级实验室。小鼠饲养环境保持室温在24～26 ℃，湿度为55%～60%。

实验试剂：75%酒精、戊巴比妥钠、生理盐水、葛根素(成都埃法 3681-99-0)、EASYspin Plus骨组织RNA快速提取试剂盒、2× SYBR Mixture 荧光定量试剂盒(北京天根(Cat# FP-205-2)、PTEN抗体(稀释比例1：90 Cat:AF6351 Affinity)、catalase抗体(稀释比例1：90 Cat：DF7545 Affinity)、P-AKT(稀释比例1∶90 Cat：AF0016 Affinity)、山羊抗兔Ig二抗(Cat：PV-6001 北京中杉金桥生物技术有限公司)、DAB显色试剂盒(Cat：ZLI-9019北京中杉金桥生物技术有限公司)、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(C0105，碧云天)；荧光倒置显微镜(2015236500，Leica DMI3000B)。

1.2 方法

1.2.1建立去卵巢小鼠模型：将动物随机分为假手术组(Sham)、去卵巢组(Ovx)、葛根素组(Pue)。取3%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)，注射小鼠，待小鼠行动迟缓进入麻醉状态后，采用75%酒精局部消毒，从小鼠两侧背部纵向切开进入腹腔，找到两侧粉红色样的卵巢组织并切除。假手术组切除两侧的脂肪样组织作为对照。缝合固定并用庆大霉素消毒伤口连续消毒3 d防止伤口感染。将摘除的组织固定切片并行HE染色鉴定是否为卵巢组织。

1.2.2给药方法：葛根素组(Pue)采用无菌生理盐水将葛根素溶解，按每只2.5 mg/100 μL进行腹腔注射，假手术组(Sham)和去卵巢组(Ovx)采用无菌生理盐水等量腹腔注射。

1.2.3检测指标及检测方法：①HE染色：将卵巢组织固定并石蜡包埋切片，然后用二甲苯脱蜡再用各浓度乙醇脱水，滴加苏木精染液染色5 min，自来水冲洗。使用盐酸乙醇分化数秒再用自来水冲洗加入伊红染液。然后进行脱水、透明、封片、显微镜观察，拍照。将小鼠股骨脱钙处理后按照上述染色方法行HE染色；②Micro-CT 取各组小鼠的股骨标本清理干净周边组织然后放入4%多聚甲醛中固定24 h后进行Micro CT扫描，得到三维Micro CT数据；③real-time PCR：采用EASYspin Plus骨组织RNA快速提取试剂盒提取样本中总RNA，根据试剂盒操作按95 ℃，15 min，1个循环；95 ℃，10 s，58 ℃，30 s，72 ℃，30 s共40个循环进行PCR反应。β-actin上游引物序列为GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，下游引物序列为GCCGGACTCATCGTACTCC；PTEN上游引物序列为TGGATTCGACTTAGACTTGACCT，下游引物序列为GCGGTGTCATAATGTCTCTCAG；FoxO1上游引物序列为ATGCTCAATCCAGAGGGAGG，下游引物序列为ACTCGCAGGCCACTTAGAAAA；catalas上游引物序列为AGCGACCAGATGAAGCAGTG，下游引物序列为TCCGCTCTCTGTCAAAGTGTG。④免疫组化：将骨组织切片脱蜡，DAB显色，使用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，染色步骤严格按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 去卵巢小鼠模型建立及评价

2.1.1卵巢组织的摘除：从小鼠背部双侧纵向切开，找到两侧粉红色样的卵巢组织切除并进行HE染色，镜下可见初级卵泡、次级卵泡。初级卵母细胞、透明带，卵泡细胞等清晰可见，说明卵巢组织摘除成功。结果见图1。

2.1.2卵巢组织摘除前后子宫形态对比：与Sham组相比，Ovx组小鼠子宫萎缩变小、输卵管变细、长度缩短、管腔变窄、弹性下降。结果见图2。

2.1.3卵巢组织摘除前后Micro-CT对比：与Sham组相比，Ovx组小鼠股骨的骨小梁结构稀疏、断裂明显、骨皮质变薄、骨髓腔变大。与Ovx组相比，Pue组小鼠骨小梁增多、断裂减少、骨髓腔缩小。结果见图3。

2.1.4卵巢组织摘除前后骨组织结构变化：Sham组股骨组织结构致密、骨小梁连接紧密、排列规律、少见断裂、骨髓腔大小正常。与Sham组相比，Ovx组股骨组织分离度增大、骨小梁断裂严重、骨髓腔明显增大、空洞增多。与Ovx组相比，Pue组小鼠股骨组织骨小梁明显增多、连接增多、骨小梁之间的间隙缩小、骨髓腔变小、结构更致密。结果见图4。

2.2 葛根素干预后各组的PCR和免疫组化结果

2.2.1葛根素干预后各组的PCR结果：与Ovx组相比，Pue组可以上调PTEN、Foxo1、Catalase的mRNA表达，PTEN、Catalase的差异有统计学意义，但是Foxo1的mRNA改变无统计学意义。

2.2.2葛根素干预后各组的免疫组化结果：与Sham组相比，Ovx组的PTEN、catalase蛋白表达差异不明显，而P-AKT蛋白表达增加。与Ovx组相比，Pue组的去卵巢小鼠骨组织内阳性颗粒增多PTEN、catalase蛋白表达升高，P-AKT蛋白表达下调但变化差异不明显。

3 讨论

骨质疏松症是一种以骨密度降低，骨微结构退化，骨折风险增加为特征的疾病。主要是由于骨吸收和骨形成之间的不平衡造成的[9]。骨质疏松症主要累及老年人，由于老龄化形势的日益严峻，该疾病不仅对个人生活造成了极大影响，同时对于国家和社会来说也是一个沉重的负担。目前椎体成形术，对于治疗骨质疏松症致脆性骨折有一定疗效[10]，但是骨折带来的危害依然不容小觑。葛根素是一种植物雌激素，具有保护心脑血管、抗炎、抗氧化等功效[11]。方晓燕等[12]研究发现山茶籽和葛根素对去卵巢大鼠的骨质疏松具有防治作用，但其具体作用机制尚不清楚。正如本研究所示，通过摘除小鼠双侧卵巢可以成功构建绝经后骨质疏松症模型，经过葛根素干预后小鼠的骨小梁增多，断裂减少，骨髓腔缩小，说明葛根素对于骨质疏松症具有良好的治疗作用。此外，与模型组相比，葛根素组PTEN的mRNA和蛋白表达均升高，说明PTEN可能对于葛根素治疗骨质疏松症具有重要作用。

第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)是一种抑癌基因，具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶双重活性。PTEN通过使磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)的产物磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)脱磷酸化为磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)，抑制了蛋白激酶B(PKB/AKT)的磷酸化激活(p-AKT)，从而达到负性调控PI3K-AKT信号通路的作用[13]。PI3K-AKT信号通路对于细胞的生长、增殖、分化具有重要调节作用[14-15]。当细胞受到信号刺激后，PI3K产生的PIP3使具有PH结构域的AKT转移到细胞膜上，然后在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2(PDK2)的辅助下，将AKT蛋白的苏氨酸磷酸化位点(Thr308)和丝氨酸磷酸化位点(Ser473)磷酸化激活。磷酸化激活后的AKT进一步影响下游的靶蛋白，从而发挥其促进细胞生长、增殖、抑制凋亡的功能。研究表明，PI3K-AKT信号通路通过促进成骨细胞增殖、分化和骨形成而参与骨质疏松的抑制作用[16]。PI3K/AKT/GSK3β/NFATc1信号轴在RANKL诱导的破骨细胞形成中起着非常重要的作用[17]。以上研究表明，PI3K-AKT信号通路通过选择性地影响成骨细胞和破骨细胞的生理功能，在维持骨量的动态平衡中发挥重要作用。

另外，氧化应激过程中产生的大量活性氧通过促进破骨细胞的生成从而加重骨质疏松症的进程[18-20]，这说明氧化应激也参与了骨量的调节，是骨质疏松症的危险因素。本研究进一步通过PCR和免疫组化实验发现，与模型组相比，葛根素组小鼠的PTEN、FoxO1、catalase的mRNA均上调，PTEN和catalase的蛋白表达水平上升，p-AKT蛋白表达水平下降。叉头盒O转录因子(forkhead box O transcription factors，FoxOs)是重要的抗氧化因子，在4种FoxOs蛋白中(FoxO1、FoxO3、FoxO4、FoxO6)，只有FoxO1对成骨细胞和破骨细胞的功能有影响。Foxo1通过上调过氧化物酶(catalase)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)等抗氧化酶的表达在调节骨量的稳定中发挥重要作用。以上结果表明，葛根素可能通过介导PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制绝经后骨质疏松症。另有研究[21]发现，白藜芦醇通过抑制PI3K-AKT信号通路上调了Foxo1的转录活性，从而增强了对氧化损伤的抵抗力并抑制了破骨细胞的生成。葛根素同白藜芦醇一样具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等功效。葛根素通过抑制破骨细胞中PI3K-AKT信号通路使得叉头盒O转录因子1(forkhead box O transcription factor 1，FoxO1)高表达，使过氧化物酶(catalase)等抗氧化酶的表达来清除活性氧，从而达到治疗骨质疏松症的目的[22-23]。由于绝经后骨质疏松症中破骨细胞功能亢进[24-25]，猜想葛根素是否也可以通过升高PTEN负性调节PI3K-AKT信号通路，从而抑制破骨细胞的生成，进而达到治疗骨质疏松症的目的仍需进一步探索。