麦角甾苷治疗对去卵巢大鼠骨质疏松症保护机制研究

王海生 马涛 张敏 陶周善

1. 皖南医学院第一附属医院弋矶山医院手足踝外科，安徽 芜湖 241000

2. 皖南医学院第一附属医院弋矶山医院创伤骨科，安徽 芜湖 241000

骨质疏松症是一种严重威胁健康的全身性骨骼疾病，其特征是骨量减少和骨小梁结构破坏，是骨折的最重要危险因素之一[1]。随着世界范围内老年人口的不断增加，骨质疏松症的出现越来越普遍，有研究预测50岁以上的女性和男性中有50%和20%的人会在今后的人生中经历一次或多次骨质疏松骨折，这也给骨质疏松的预防和治疗带来了巨大的挑战[2]。尽管目前用于治疗骨质疏松症的药物确实疗效显著，但可能出现与这些药物有关的各种不良反应使其推广使用远未达到理想[3]。麦角甾苷(MJZG)又称马鞭草苷、毛蕊花糖苷，是存在于包括马鞭草属、肉苁蓉属植物在内的数十种药用植物中具有代表性的苯乙醇苷成分之一。近年来的研究发现其有多种优异的生物活性，包括抗氧化[4]、抗炎[5]、神经保护和改善肌肉萎缩特性[6]，因此受到更多的关注。RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信号通路在骨代谢中对破骨细胞活性调控可发挥重要作用[7]。有研究[8]还发现MJZG可以通过阻断破骨细胞的激活来减少骨丢失。所有上述证据都与我们的假设一致，即MJZG可能具有骨保护和减少骨量丢失的作用，且可能和RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信号通路有关。因此，本研究通过去卵巢模型旨在探讨MJZG对绝经后骨质疏松症可能作用并探索对RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信号通路影响。

1 材料和方法

1.1 动物分组和治疗

由南京实验动物中心提供的30只雌性SD 大鼠(12周龄)，初始体重为(206±21)g，被安置在标准无病原体的规范实验动物饲养环境中[温度控制在(24.0±0.5) ℃，45 %～50%的湿度和12/12小时明暗照明循环]。允许所有大鼠自由获得自来水和饮食。适应环境1周后，在无菌条件下通过腹腔内注射7 %水合氯醛(100 mg/kg)麻醉大鼠。然后对大鼠打开腹腔进行不切除卵巢手术(假手术，Sham)，或进行双侧卵巢摘除术(去卵巢手术，OVX)；随后大鼠分为3组：Sham组、OVX组和麦角甾苷治疗组(MJZG)，每组10只大鼠。其中MJZG组每天给予100 mg/kg麦角甾苷(成都格利普生物科技有限公司提供，纯度>98%)灌胃治疗。所有大鼠均不间断治疗12周，并根据体重每周调整一次剂量，本实验使用的剂量参考国外研究中100 mg/kg麦角甾苷可以取得较好的疗效[9]，因此使用该剂量。在治疗12周后，所有大鼠在过量麻醉下进行处死，收集血液以4 000 r/min离心15 min收集血清，解剖出双侧股骨并保存在-80 ℃冰箱备测。本研究得到医院伦理委员会批准(LLSC-2020-082)。

1.2 生物力学测试

使用生物力学机(3220, Bose corporation, Endura TEC systems group, Minnetonka, MN, USA)通过三点弯曲测试测量大鼠股骨的生物力学特性，包括最大载荷和刚度。测量过程中需要用V型弯曲夹具固定股骨的远端和近端，将完整的股骨水平放置，正面朝上，然后在间隔20 mm的两个支架上以0.02 mm/s的恒定加载速度加载股骨，并在此过程中记录载荷和位移曲线，直到股骨骨折。通过对荷载位移曲线的分析，得到最大荷载和最大刚度。

1.3 骨小梁微观结构分析

右股骨干骺端的骨小梁微结构是通过使用微型计算机断层扫描(Micro-CT)系统(Micro-CT；Y. Cheetah；YXLON International GmbH，德国)确定，在三个空间维度上的分辨率为8 μm。选择远离股骨远端的感兴趣区域，在生长板开始平扫至生长板材下方2 mm处。骨形态参数包括骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁体积分数(BV/TV)、骨小梁数(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)，通过使用ABA骨分析软件分析感兴趣区域来获得。

1.4 生化参数分析

使用自动分析仪(Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)检测血清生化参数水平。血清DPD、TRACP-5b和骨钙素均使用Elisa试剂盒(Mountain View, CA, USA)进行测量。

1.5 蛋白质印迹

股骨在液氮中裂解，随后将裂解的骨组织使用含有0.5 mmol苯基甲基磺酰氟，蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液裂解。接下来，将裂解物离心，并通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室温下用5 %脱脂牛奶封闭60 min后，用TRAF6(1∶500)、RANKL(1∶500)、RANK(1∶500)、NF-κB(1∶500)、PI3K(1∶500)、AKT(1∶500)、NFAT2(1∶500)、IKKβ(1∶500)、c-Fos(1∶500)和GPADH(1∶1 000)抗体，然后用这些抗体使膜在4 ℃下培养过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶2 000)孵育；最后，通过图像实验室软件检测印迹。重复蛋白质印迹实验3次，将GPADH用作内部对照。

1.6 统计学处理

所有数据均使用均数±标准差表示，所有分析均使用SPSS 19.0软件进行。组间使用单因素方差分析(ANOVA)进行；P<0.05表明比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE切片分析

大鼠股骨干骺端松质骨HE染色显示，与Sham组相比，去卵巢后大鼠骨小梁数量出现明显减少、间距显著增加；大量部位被脂肪细胞所代替，而麦角甾苷治疗后的大鼠则观察骨小梁明显增加，且脂肪细胞重新被骨小梁所代替 (图1)。

2.2 生物力学检测

卵巢切除术后12周，与Sham组相比，OVX组的最大负荷和刚度显著降低(P<0.05)。与OVX组大鼠相比，MJZG给药时，最大负荷和刚度水平显著增加(P<0.05)。见图2。

2.3 MJZG预防去卵巢大鼠的骨量丢失

本研究使用Micro-CT评估MJZG对OVX大鼠股骨干骺端骨小梁的微结构。如图3所示，与Sham组相比，OVX组大鼠BMD、Tb.Th、BV/TV、Tb.N显著降低，而Tb.Sp明显升高(P<0.05)。然而，相比于OVX组，用MJZG治疗的OVX大鼠剂量依赖性地增加了BMD、Tb.Th、BV/TV、Tb.N并显著降低Tb.Sp(P<0.05)。

2.4 MJZG对骨代谢指标的影响

骨代谢指标碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素 (BGP)、抗酒石酸的酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)和脱氧吡啶啉(DPD)检测结果如图4所示，与Sham组相比，卵巢切除术可显著升高BGP、ALP、TRACP-5b和DPD的水平(P<0.05)。值得注意的是，与OVX组相比，用MJZG治疗后的OVX大鼠中BGP、ALP、TRACP-5b和DPD水平显著降低(P<0.05)。

2.5 蛋白印记检测结果

各组大鼠股骨干骺端骨组织TRAF6、RANKL、NF-κB、NFAT2、PI3K、AKT和c-Fos表达检测如图5所示，和OVX组比较，MJZG组的TRAF6、RANKL、NF-κB和NFAT2的蛋白水平表达下调(P<0.05)，而PI3K、AKT和c-Fos上调(P<0.05)。MJZG可以通过抑制RANKL/TRAF6/NF-κB和激活PI3K/AKT来防治OVX大鼠骨量丢失。

3 讨论

本研究结果表明，麦角甾苷可以增加骨密度和生物力学性能，并改善大鼠股骨干骺端骨小梁的微结构，并最终防止卵巢切除术引起的骨质疏松大鼠的骨质流失。

BMD是诊断骨质疏松的主要标志之一[10]，Micro-CT检测还用于提供小梁微体系结构的其他直接信息，以评估骨的脆性[11]。Micro-CT技术可以代替组织学染色，为股骨干骺端骨小梁微结构提供直观和定量数据，并且通过Micro-CT三维重建提供的骨小梁3 D图像更为直观，可以观察到骨小梁的结构，并定量数据包括BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BV/TV。因此，从Micro-CT获得的数据对于骨质疏松症诊断和治疗更具体和全面。在本研究中，麦角甾苷治疗显著改善了OVX大鼠的BMD，骨微观参数也得到了明显改善，包括Tb.N、Tb.Th和BV/TV；而Tb.Sp的明显降低；此外，麦角甾苷治疗还能显著提高了包括最大负荷和刚度在内的生物力学参数。

骨代谢指标是血液和/或尿液中在骨形成或骨吸收过程中释放的生化标志物，可以及时准确地反映全身骨代谢。骨代谢指标的检查并不昂贵且无创，并且骨代谢指标可以重复测量。治疗后骨代谢指标的变化可能比通过双能X射线吸收法测量的BMD的变化更有意义[12]。骨代谢指标对骨质疏松症的治疗可能显示出巨大而快速的反应，这可能是最佳剂量和剂量频率选择[12]。在绝经后骨质疏松症的过程中，股骨骨密度的降低和股骨干骺端骨微结构的破坏总是伴随着包括ALP、BGP、TRACP-5b和DPD在内的骨重塑标志物的显著变化[13]。TRACP-5b和DPD是骨吸收的典型标志物，而ALP和BGP是广泛使用的骨形成指标[14]。麦角甾苷的治疗可显著降低OVX大鼠的ALP、BGP、TRACP-5b和DPD的水平，这表明麦角甾苷能显著降低去卵巢大鼠提高的骨转换速度。

骨骼的重建和重塑是一个复杂的生理过程，需要有破骨细胞的功能[15]。由于雌激素水平急剧下降，破骨细胞的活性和分化能力在绝经后显著增加[15]。RANKL及其受体RANK是破骨细胞祖细胞的两个关键分化因子，能够刺激破骨细胞分化，然后介导破骨细胞形成[16-17]。此外，RANKL与RANK的结合可激活多种下游信号通路，包括NF-κB和PI3K /AKT，以及一些转录因子，包括NFAT2和c-Fos[7]，从而刺激了破骨细胞的发展和破骨细胞生成。然而，除非募集了TNF-受体相关因子(TRAF)，并且下游信号级联被转导，否则RANK受体蛋白缺乏固有的酶活性，因此认为TRAF6是主要的衔接子分子，可能对破骨细胞的功能和分化有用[18]。因此，RANKL/TRAF6/NF-κB信号通路认为是解释破骨细胞形成的重要机制。在本研究中，麦角甾苷降低了RANKL、TRAF6和NF-κB，导致PI3K/AKT被激活，最终，NFAT2的水平减少和c-Fos的表达增加。

综上，麦角甾苷可能通过RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信号通路介导对OVX大鼠骨量流失产生保护作用，但是本研究未进一步进行阳性对照实验和通路抑制和激活来证实其潜在的机制，后期会通过激动剂和抑制剂研究观察麦角甾苷对骨髓间充质干细胞增殖分化以及成骨和破骨细胞的影响。