PM2.5悬滴液对去势后雌性SD大鼠骨密度的影响

张小蕊 黄惠娟 林妹珠倪清丽 王海红 杨荟 张贤丹 李秋月 游梦婷梁启妍

1.福建医科大学福总临床医学院妇产科，福建 福州 350025

2.中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院妇产科，福建 福州 350025

3.厦门大学附属东方医院，福建 福州 350025

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是指女性绝经后卵巢内分泌功能失调衰退，雌激素水平明显减少，导致以骨量减少、骨的微观结构退化为主要特征的一种全身代谢性疾病，易发生骨折。骨折以发生在腰部、股骨上端、腕骨较为常见。目前骨质疏松症(osteoporosis，OP)诊断的主要基于双能X射线吸收测定法(DXA)骨密度(bone mineral density，BMD)测量结果和(或)脆性骨折[1]。PM2.5是指空气动力学等效直径等于和小于2.5 μm的大气颗粒，其基本特征是体积小、重量轻，在大气中滞留时间长，可以被大气环流输送到很远的地方，因而对人体健康的影响很大[2]。根据相关研究发现，北京空气中的PM 2.5浓度最高可达82.6 μg/m3[3]，同期北京当地居民的50～59岁骨质疏松发病率为18.9%，60～69岁为52.21%，70～79岁为77.59%，80岁以上为95.24%，均高于同期PM2.5浓度较低的城市[4]。既往研究[5-7]表明，PM2.5可通过影响骨代谢的炎性效应机制、受体竞争机制、雌孕激素受体机制等多种途径降低骨密度，直接或间接引发或加剧OP。但PM2.5对于绝经后骨质疏松的影响机制还有待探讨。本研究拟通过观察PM2.5悬滴液滴注对去势后雌性SD大鼠骨密度的影响，为PM2.5污染与绝经后女性骨质健康的关系提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

40只3周龄雌性Sprague-Dawley健康大鼠，动物的数量由前期预实验结果统计学计算得出，购买上海于克莱斯实验动物有限责任公司，体重为(60±10)g，实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0001。按照随机数字表法将其分成对照组和实验组，每组20只，饲养在联勤保障部队第九○○医院比较医学科动物实验中心SPF级动物房，提供专用饲料饲养，保证每日光照时间一定，室温 18～25 ℃，自由摄食和饮水。动物实验管理依照实验动物管理委员会指导方案进行。

1.2 PM2.5的采集及配置

2018年4月至2019年4月，在联勤保障部队第九○○医院妇产科病房楼楼顶(靠近福建省福州市鼓楼区西二环北路交通繁忙路段)用大流量采样器和PM2.5采样头，收集本地区大气PM2.5样本。每连续采样24 h更换一次滤膜。采样后的滤膜用锡纸包裹，置于4 ℃保存。将PM2.5萃取后依据《中华人民共和国环境空气质量标准》(GB3095-2012)一、二级标准日均浓度限值及我国城市PM2.5年平均浓度水平推算，将PM2.5粉末称重，加入PBS磷酸缓冲盐溶液配制成浓度为剂量75 μg/m3的悬浊液，保存于4 ℃冰箱中。

1.3 PM2.5暴露标准与气道滴注方法

每天早上8：00开始，用乙醚麻醉雌鼠后，用气管滴注法滴入大鼠肺部进行染毒试验。依据《中华人民共和国环境空气质量标准》(GB3095-2012)一、二级标准日均浓度限值及我国城市PM2.5年平均浓度水平，以及国际环保组织绿色和平发布的《2015年度中国366座城市PM2.5浓度排名》中PM2.5年均浓度150 μg/m3及参照吸入的PM2.5在气道深部和肺的沉积率为70%进行计算，计算得出大鼠24 h PM2.5吸入量分别为：5.52 μg/d。每隔2 d滴注1次，持续染毒9个月。

1.4 大鼠去势术

PM2.5气道滴注5月末，实验组大鼠行双侧卵巢切除术，对照组大鼠行双侧卵巢旁脂肪组织摘除术。大鼠于手术前一天禁食禁水6～8 h，使用3%浓度的戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射麻醉(1 mL/kg)，于大鼠中下背部备皮，手术切口选择双侧背部长度约1 cm的纵行切口，术中于卵巢与子宫末端之间的最细处用小号止血钳夹闭，1号丝线结扎后切除全部卵巢，还纳后分别缝合肌肉层和皮肤，对皮后酒精棉球消毒手术切口。术后3 d进行肌注20万单位的青霉素1 mL/d。对照组采用同法切除双侧卵巢旁脂肪组织。

1.5 骨密度测量

在气道滴注实验进行的第5、7个月末及9月末，对大鼠各部位进行骨密度的测量，每次检测前一天禁食禁水8 h，用3%浓度的戊巴比妥钠对大鼠进行腹腔注射麻醉(1 mL/kg)，运用双能X线测量仪设备(来源于福建省中医药研究院)在高分辨率模式下对大鼠右胫骨、右股骨、腰椎 (L4～L6)扫描。在实验过程中大鼠因手术或麻醉等原因出现死亡，至实验结束，对照组大鼠剩13只，实验组大鼠剩16只。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 PM2.5滴注5月末两组骨密度比较

染毒5月末(未去势前)，测量对照组和实验组胫骨、股骨、腰椎3个部位的骨密度，将对照组和实验组的3个部位骨密度分别进行比较，两组胫骨、股骨、腰椎的骨密度差异均不具有统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 5月末骨密度变化Table 1 Bone mineral density change at the end of g/cm2)

2.2 离体后两组骨密度变化

手术后持续染毒4个月后取大鼠右胫骨、右股骨及腰椎L4～L6离体测BMD(表2)，实验组与对照组的胫骨、股骨、腰椎的骨密度差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表2 离体后骨密度变化Table 2 Change of bone mineral density after g/cm2)

2.3 对照组各部位骨密度变化

随着染毒时间的增加，对照组3个部位骨密度均呈下降趋势，其下降程度：腰椎>股骨>胫骨。见图1。

2.4 实验组各部位骨密度变化

随着染毒时间的增加，实验组3个部位骨密度均呈下降趋势，其下降程度：腰椎>股骨>胫骨。见图2。

2.5 实验组与对照组股骨骨密度变化情况比较

随着染毒时间增加，在同一时间段内实验组股骨骨密度下降程度比对照组骨快，见图3。

2.6 实验组与对照组腰椎骨密度变化情况比较

随着染毒时间增加，同一时间段内实验组腰椎骨密度下降程度比对照组快，见图4。

2.7 实验组与对照组胫骨骨密度变化情况比较

随着染毒时间增加，在7月末实验组和对照组胫骨骨密度较5月末均有下降，且实验组骨密度下降程度比对照组快；在9月末实验组与对照组胫骨密度均有所增加，且实验组骨密度上升程度比对照组慢。见图5。

3 讨论

从19世纪40年代Albright提出绝经后骨质疏松与雌激素减少密切相关后，研究证实，雌激素水平的降低是绝经后骨质疏松发病的首要因素[8]。雌激素通过促进IL-6、IL-1产生及抑制骨吸收抑制因子的作用使破骨细胞形成增加和抑制TGF-β及IGF作用抑制骨形成等途径使骨量减少[9]。已有研究[10]表明，在中国同一地区内绝经前妇女骨质疏松患病率(1.8%～3.2%)远低于绝经后妇女患病率(9.4% ～ 37.9%)。本实验采用雌性SD大鼠进行研究，去势前PM2.5气道滴注5月末测量实验组与对照组骨密度变化，结果显示实验组与对照组胫骨、股骨和腰椎组间骨密度均未见明显差异(表1)。对实验组和对照组分别行去势手术和假去势手术后PM2.5持续气道滴注4个月，再次测量BMD，结果显示在相同PM2.5暴露时间下，去势后SD大鼠腰椎、股骨和胫骨骨密度均较未去势SD大鼠低(表2)，且随着PM2.5气道滴注时间的增加，卵巢去势后雌性SD大鼠腰椎和股骨骨量的丢失速度显著加快(图3、图4)。

临床发现，不同骨骼部位骨量丢失的程度不同。绝经后骨质疏松症所致的骨折常发生于脊柱、股骨颈和桡骨远端等富含松质骨的部位，其中以腰椎最为常见。大量研究也表明，绝经后妇女腰椎部位骨量的变化最明显。本研究结果显示，在相同浓度PM2.5暴露下，去势后大鼠腰椎骨密度下降程度比股骨和胫骨明显(图2)。当雌激素缺乏时，骨转换增加，破骨细胞过于活跃，其功能相对或绝对增强，骨重建呈负平衡，引起骨量丢失，松质骨骨小梁丰富，其对雌激素缺乏所致的骨量丢失的敏感性大于皮质骨。本研究结果与文献报道一致[11]。

目前我国社会老龄化越来越严重，而随着老龄化人口所占比例的上升，PMOP的患者也正逐年增多，而空气污染的进一步加重无疑是对PMOP患者病情的重大威胁。PMOP大大影响了绝经后妇女的生活质量，据调查，绝经后的5～10年是骨质疏松发生的高峰期，且发病率会随着年龄增长而增高。所以为改善绝经后妇女骨质疏松及骨质疏松骨质发生，需要有效的预防措施，其中控制空气污染正是关键措施之一。

本项目通过动物实验来研究PM2.5悬浊液对绝经后SD大鼠骨密度变化的影响，证明环境中的PM2.5对绝经后骨质疏松具有一定的作用，但具体影响的机制有哪些，是怎样的作用原理，需要进一步探究与证实。虽然大鼠骨质疏松的模型建立后出现的绝经后骨质疏松变化与人类相似，但大鼠的骨结构及代谢还是与人类的有所不同，且人类生存环境中空气污染的程度不同，每个人的个体差异也均较实验大鼠差异性大，所以如果能结合流行病调查研究本研究结果将更具有说服力。希望通过本研究能有更多的实验来研究PM2.5对绝经后骨质疏松的影响；也希望能引起更多的人重视环境污染的问题，减少PM2.5的排放，来降低其对女性绝经后骨质疏松的影响，使女性绝经后生活质量得到更大的提升。