miR-381-3p通过靶向ERK1/2/ETS1信号通路影响MC3T3-E1细胞成骨分化

陈锦成 朱国涛 秦晓飞 陈彦丞 罗骏 余博飞 吴宜璟 徐杰*

1.福建中医药大学中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122

2.福建省立医院骨二科，福建医科大学，福建 福州350001

课题组前期利用Illuminanc高通量测序技术在肌少-骨质疏松症[1]患者和骨质疏松症患者的肌肉组织中检测到了存在差异性表达的miRNA，其中肌少-骨质疏松症组中miR-381-3p呈10.57倍的上调表达，且经实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证[2]，表明miR-381-3p可能参与肌少症患者容易发生骨量丢失的病理过程[3]。通过利用TargetScan7.2软件[4]对miR-381-3p 可能调控的靶点进行预测，综合预测结果发现其靶基因可能为ETS1。

MicroRNA是一类广泛存在于真核生物当中，长度在21～23个核苷酸的单链小分子RNA[5]。成熟的miRNA 通过形成沉默复合体，再通过完全或不完全配对与特定靶基因的3’UTR结合，起到抑制mRNA翻译或是直接降解mRNA的作用，从而影响了靶基因的表达水平[6]。据报道miRNA在维持骨骼发育和新陈代谢方面起着至关重要的作用[7]。Elias等[8]发现ETS1属于调控骨骼生成的转录因子；ETS1可存在于胞核内，激活的ERK1/2二聚物可以直接刺激修饰ETS1，同时直接抑制修饰成脂分化特异性指标PPARγ[9]；此外，ETS1可通过与许多骨基质蛋白(ALP、Runx2、collagen I)基因DNA上特殊的调节区相结合，来激活并调节这些基因的表达。Fan等[10]研究发现ETS1对骨组织的发育和成骨细胞的分化与成熟起重要的调控作用。唐乖等[11]通过miRNA 靶基因预测工具对hsa-miR-381-3p进行生物信息学分析后发现，miR-381-3p的靶基因集合显著富集于MAPK、Wnt、P53 等信号通路中，这三者均是调控成骨分化的重要通路[12-13]，而ETS1属于MAPK/ERK1/2信号通路下游重要的转录因子。综上，本课题拟研究miR-381-3p是否通过调控ERK1/2信号通路而抑制ETS1活性，最终影响MC3T3-E1细胞的成骨分化水平。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要实验仪器设备：主要实验仪器设备见表1。

表1 主要实验仪器设备Table 1 Main experimental equipment

1.1.2主要实验试剂：主要实验试剂见表2。

表2 主要实验试剂Table 2 Main experimental compounds

1.1.3实验细胞株：在中国科学院细胞库购买小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 subclone14)细胞株 (批号：GNM15)。

1.2 实验方法

1.2.1构建miR-381-3p过表达和低表达细胞模型及实验分组：根据汉恒慢病毒说明书进行转染，转染72 h后换上2 μg/mL浓度的嘌呤霉素的新鲜培养基，筛选出稳转株。采用qRT-PCR检测转染效率。细胞实验分为NC mimic miR-381-3p组、mimic miR-381-3p组、NC inhibitor miR-381-3p组和inhibitor miR-381-3p组，随后4组均进行成骨诱导分化干预并检测相关实验指标。

1.2.2各组细胞中ALP的活性测定：用成骨诱导分化的培养液 (50 μg/mL抗坏血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松) 连续诱导干预MC3T3-E1细胞7 d，每72 h换液1次，收集各组细胞干预后的培养液，然后2 000 r/min，离心8 min取上清液进行测定；向96孔板内加50 μL基质液、50 μL缓冲液和30 μL样品，充分混匀37 ℃孵育15 min；添加150 μL显色剂，轻轻振摇孔板混匀，酶标仪测定波长520 nm各孔的吸光度OD值；得到各组ALP活性原始实验数据后根据说明书中酶活性计算公式操作并统计分析实验数据。

1.2.3各组细胞茜素红染色(ARS)检测：各组MC3T3-E1细胞血清饥饿24 h，加入成骨诱导分化培养液继续培养2周后，将各组细胞6孔板中的诱导分化培养液吸取干净，用2 mL的1×PBS清洗2次；每个培养孔中加2 mL的4%中性甲醛溶液，室温固定15 min后；中性甲醛溶液去除，用2 mL的1×PBS溶液清洗2次；每个培养孔中沿边加2 mL茜素红染液室温避光染色15 min后；茜素红染液去除干净，再用2 mL的1×PBS缓慢冲洗3次减少染色背景干预；显微镜下观察各组细胞成骨分化ARS染色情况并拍照记录。

1.2.4实时荧光定量PCR测定各组细胞目的基因mRNA的表达水平：采用Trizol法提取各组细胞总RNA，利用超微量分光光度计测定RNA的浓度和纯度质检；各组定量后根据Takara反转录试剂盒使用说明书操作，将mRNA反转录为cDNA模板，反应体系20 μL。ALP、Runx2、ETS1、PPARγ、miR-381-3p、内参基因GAPDH和U6的引物序列及反应条件见表3。按照下列条件进行qRT-PCR反应：①预变性条件 95 ℃，30 s 1个循环；②PCR反应程序设置 95 ℃，5 s ；60 ℃ 30 s ，40个循环；③溶解曲线程序95 ℃，15 s ；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。软件导出原始数据，以GAPDH作为内参，每组复孔3个，域值循环数(CT)值取均数。本实验运用2-ΔΔCt算法对各组样本目标基因表达水平进行相对定量分析，依据此数据统计分析与绘制柱状图。

表3 引物序列及反应条件Table 3 Primer sequences and reaction condition

1.2.5各组细胞中ALP、collagen Ⅰ、Runx2、ETS1、PPARγ、P-ERK1/2蛋白表达的检测MC3T3-E1细胞稳转株按分组条件培养14 d后，用4 ℃预冷2 mL的PBS液清洗2次，加入RIPA裂解液裂解细胞，离心，收集细胞上清液以获得总蛋白，利用BCA蛋白定量法测定各组蛋白浓度，取5×蛋白上样缓冲液与样品涡旋混匀后金属浴(99 ℃)煮沸10 min将蛋白变性。每个泳道20 μg蛋白样品进行上样，10 %聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭液室温摇床封闭1 h，加入稀释好的一抗，在4 ℃冻库的摇床上孵育过夜，1×TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP二抗后室温摇床结合1 h，1×TBST清洗3次，每次5 min；加入超敏ECL化学发光试剂并用凝胶成像系统显影，条带用Image Lab 5.2软件分析，目标蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值之比为校正后蛋白灰度值，并数据统计分析与绘制成柱状图。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 MC3T3-E1细胞慢病毒转染miR-381-3p荧光表达情况

MC3T3-E1细胞转染带绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的病毒并筛选成稳转株后可在荧光显微镜观测到GFP表达效率，图1为4组MC3T3-E1细胞在显微镜明场和荧光显微镜下拍摄结果，可见4组细胞GFP荧光表达均较强，转染效率较高。

2.2 MC3T3-E1细胞中miR-381-3p转染效率qRT-PCR检测

分别在4组MC3T3-E1细胞中感染对应的病毒，经过嘌呤霉素筛选后构建成稳转株，采用qRT-PCR检测各组miR-381-3p的表达水平；NC mimic miR-381-3p组与mimic miR-381-3p组比较，差异倍数高达104.66倍(P<0.05)；NC inhibitor miR-381-3p组和inhibitor miR-381-3p组相比，差异倍数为0.74倍(P<0.05)，证明miR-381-3p表达水平被抑制；4组中miR-381-3p转染效率经qRT-PCR验证达到预期结果(图2)，细胞实验模型构建成功。

2.3 茜素红染色(ARS)

各组MC3T3-E1细胞成骨诱导分化培养14 d后，NC mimic miR-381-3p组和NC inhibitor miR-381-3p组经ARS仅见少许散在的橘红色钙化结节 (图3A和3C)，mimic miR-381-3p组经ARS未见形成具有代表性的橘红色的钙化结节 (图3B)；而inhibitor miR-381-3p组经ARS细胞视野可见大片散在或连成一片分布于细胞表面的橘红色经典钙结节(图3 D)。4组细胞茜素红染色结果采用Image J软件进行定量分析并运用GraphPad Prism8.4.2软件进行统计分析(图4)。

2.4 碱性磷酸酶(ALP)活性测定MC3T3-E1细胞的成骨分化能力

诱导成骨分化干预7 d，与mimic miR-381-3p组相比，NC mimic miR-381-3p组可一定程度上调细胞ALP的活性(P<0.05)；与NC inhibitor miR-381-3p组对比，inhibitor miR-381-3p组显著上调细胞ALP的活性(P<0.05)，见图5。

2.5 各组细胞中ALP、Runx2、ETS1和PPARγ mRNA表达的比较

与mimic miR-381-3p组比较，NC mimic miR-381-3p组可上调ALP、Runx2、ETS1 mRNA表达水平，其中PPARγ mRNA的表达水平则被下调(P<0.05)；与NC inhibitor miR-381-3p组对比，inhibitor miR-381-3p组可显著上调ALP、Runx2和ETS1 mRNA表达水平，而PPARγ mRNA的表达水平则被下调(图6)，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.6 各组细胞中ALP、collagen Ⅰ、Runx2、ETS1、PPARγ和P-ERK1/2蛋白表达比较

与mimic miR-381-3p组比较，NC mimic miR-381-3p组可上调ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表达水平，其中PPARγ的蛋白表达水平则被下调(P<0.05)；与NC inhibitor miR-381-3p组对比，inhibitor miR-381-3p组可上调ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表达水平，而PPARγ的蛋白表达水平则被显著下调(P<0.05)(图7)。当使用MAPK信号通路的抑制剂PD98059后，与inhibitor+PD98059组和PD98059组对比，inhibitor组可显著上调ALP、Runx2、collagen Ⅰ、ETS1和P-ERK1/2的蛋白表达水平，其中PPARγ的蛋白表达水平显著下调(P<0.05)(图8)。

3 讨论

MC3T3-E1细胞具备定向成骨分化特性，是近年来体外研究成骨细胞分化实验的较为成熟的细胞模型[14]。在本研究中运用慢病毒转染技术[15]，构建miR-381-3p过表达与低表达细胞模型，并且在qRT-PCR与蛋白实验中证实miR-381-3p与EKR1/2/ETS1信号通路密切相关；当miR-381-3p过表达时EKR1/2/ETS1信号因子在MC3T3-E1细胞成骨分化中受到一定程度的抑制，同时成脂分化特异性指标PPARγ蛋白呈上调表达。miR-381-3p过表达通过下调生长与分化的MAPK/ERK信号通路中的两个重要靶基因EKR1/2/与ETS1表达，抑制了MC3T3-E1细胞的成骨分化；此外，miR-381-3p与PPARγ的特异性结合并激活其表达，一定程度影响了MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。

Qi和Kim等[16-17]研究表明，MAPK/ERK通路的激活在许多细胞类型的成骨分化中起重要作用。本研究中当miR-381-3p低表达时，细胞中Runx2、ALP、ETS1 mRNA和蛋白表达被上调以及下调PPARγ mRNA和蛋白的表达，并可上调MC3T3-E1细胞的ALP活性和矿化水平[18]；当miR-381-3p过表达时，细胞中Runx2、ALP、collagen Ⅰ和ETS1及P-ERK1/2的蛋白表达均显着降低，而PPARγ mRNA和蛋白表达水平则是升高的，并且下调了MC3T3-E1细胞的ALP活性和矿化水平。Runx2、ALP、collagen Ⅰ和ETS1及P-ERK1/2都是与MAPK/ERK信号通路密切相关的转录因子[19-20]；当用研究中使用MAPK信号通路抑制剂PD98059一定程度抑制P-ERK1/2表达后，下游相关的转录因子活化水平同样受到抑制。由此，证明了EKR1/2/ETS1信号因子密切参与miR-381-3p调控MC3T3-E1细胞成骨分化的过程。综上研究数据和结合梳理相关文献表明miR-381-3p的过表达可一定程度的下调EKR1/2/ETS1信号因子的表达，从而抑制了MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。

众所周知，PPARγ作为MAPK/ERK1/2通路下游的重要转录因子，其激活后可促进脂肪细胞分化并抑制成骨细胞分化，在实验中我们揭示了过表达的miR-381-3p通过与PPARγ转录因子的3′UTR结合一定程度上抑制了P-ERK1/2与ETS1的表达。

miRNA在成骨代谢过程中主要发挥序列特异性转录后的调控作用[21]，越来越多的研究表明miRNA参与各种细胞生理过程的调控，其中包括细胞增殖与分化及脂肪代谢等，还重点参与调控骨质疏松症、肌少-骨质疏松症等疾病的发生发展过程[22]。miRNA对成骨代谢调控机制较为复杂，信号通路作为调控骨代谢的重要途径，研究不同信号通路共同作用参与调节成骨代谢意义重大。以往研究更多是从miRNA直接调控或间接调控Wn通路因子活性与促进成骨细胞分化等方面开展相关研究[23]。本研究首先从筛选出特异性miRNA，然后设计实验基本阐明了miR-381-3p抑制MAPK/ERK1/2/ ETS1信号轴活性而下调成骨代谢水平的机制。本研究不仅丰富了miRNA调控信号通路影响成骨代谢内容，还为后续相关miRNA结合MAPK信号通路研究成骨代谢提供了新思路和理论依据。