糖皮质激素抑制Leptin、VEGF蛋白表达诱导骨质疏松作用机制研究

方圣杰 章轶立 朱嘉 宋庆慧 王旭 刘宁 李秋月* 魏戌*

1.中国中医科学院望京医院，北京 100102

2.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院，江苏 南京 210023

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是骨科常见的疾病之一，骨量低、骨组织微结构退化和骨强度降低是OP的主要特征[1]，OP主要分为原发性与继发性两类，其中糖皮质激素(glucocorticoid，GC)诱导的OP为最常见的继发性OP，有学者[2]对3 136例使用GC治疗风湿病患者时导致骨量减少、骨质疏松发病情况进行多中心调查，研究显示存在骨量减少或骨质疏松患者高达90%, 其中骨质疏松的发生率为41.4%。相关机制研究证实，过量的GC会影响成骨细胞的分化和成熟，导致其数量和功能下降，并促进成骨细胞凋亡，从而进一步减少骨形成[3]。为进一步更好的研制出疗效显著、价格低廉的治疗GC性骨质疏松症药物，建立可靠稳定的糖皮质激素性骨质疏松症模型(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)并阐明GC诱导的OP的病理机制成为当前首要任务[4]。

最近研究表明，GC能抑制骨髓间充质干细胞进行成骨分化，引导其分化成脂肪细胞，同时，减少肥大软骨细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达，使得成骨细胞和血流量减少[5]。Leptin作为脂肪因子的一种，存在于脂肪细胞中，相关机制研究阐明，Leptin能够通过激活Akt调控成骨细胞的增殖、促进成骨细胞分化[6]，同时，其在脂肪细胞中分泌后，释放到血液中进行循环[7]，能够引起强烈的血管生成反应，Leptin水平增加能够促进VEGF表达，与VEGF具有相互依赖性，因此被定义为促血管生成因子[8-10]。另外，骨修复过程是否受到VEGF水平影响？已有学者通过研究确证VEGF分泌能够促进骨修复，加快骨愈合，对骨缺损修复过程效果显著，因此VEGF对骨修复及成骨细胞分化有着重要作用，该观点也在医学不同领域均有报道[11-15]，基于此，本文通过GIOP模型探究GC诱导OP过程中Leptin、VEGF蛋白表达情况，阐述GC诱导OP潜在病理机制，为后续进一步科学研究及临床治疗以GIOP为代表的继发性骨质疏松症提供可靠依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

相关试剂：蛋白提取液(来源：MDL，批号：MDL91201)；蛋白酶抑制剂(来源：MDL，批号：MD912893)；BCA 蛋白浓度测定 kit(来源：MDL，批号：MD913053)；SDS-PAGE 预制胶套装 kit(来源：MDL，批号MD911919)；中等蛋白分子量 marker(来源：Thermo，批号：26617)；Leptin(来源：Bioss，批号：bs-0409R)；VEGF [来源：VEGF(C-1) sc-7269，批号：BA 0533]；二抗(来源：MDL，批号：MD912577)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；PBS 缓冲液(来源：艾普希隆生物，批号：G0002)

1.2 主要实验仪器

微量加样器(Gilson 公司，法国)；电热恒温水浴槽(上海一恒恒温设备厂，型号：HWS-24)；脱色摇床(海门其林贝尔仪器制造公司，型号：TS-100)；电泳仪(北京百晶生物技术有限公司，型号：T BG-subMIDI)；低温离心机(Sigma，德国，型号：3-30K)；凝胶成像系统(UVP，美国，型号：GelDoc-It310)；ChemiDoc MP 化学发光成像系统(Bio-rad，美国，型号：170-8280)；病理切片机 (上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016)。

1.3 实验动物

SPF级SD雌性大鼠，购自北京维通利华实验动物中心技术有限公司，每只体重220 g左右，7周龄，共32只，饲养于SPF级实验室，湿度48%左右，温度25 ℃左右，自由进食、进水，定时更换垫料。

1.4 分组与造模、取材

将大鼠随机分为SHAM、DEX 2.5 mg/kg组、DEX 5 mg/kg组、DEX 7.5 mg/kg组，每组各8只。将大鼠适应性喂养1周后开始造模，我们将地塞米松注射液(dexamethasone，DEX)分为2.5、5.0、7.5 mg/kg三种剂量，分别对相应组别大鼠选取左、右大腿内侧肌肉交替进行肌肉注射，连续注射8周。在造模8周末，采用戊巴比妥依据大鼠体重进行腹腔注射麻醉处死，取大鼠右侧胫骨和右侧股骨。

1.5 检测指标

1.5.1骨密度检测：选用双能X线骨密度测量仪进行骨密度检测，采用Osteocore3骨密度分析软件进行骨密度值的分析，选取右侧胫骨样本的胫骨骨干部进行骨密度值的采集。

1.5.2病理组织学检测：取右侧胫骨在4%甲醛中固定12 h，流水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋切片，进行HE常规染色，在显微镜下观察、拍照记录。

1.5.3免疫组织化学检测：选用右侧胫骨，进行免疫组化检测。具体步骤：先将组织切片置于盛满 EDTA 抗原修复缓冲液(PH9.0)中进行抗原修复，使用PBS洗涤3次，在切片上滴加 PBS 按一定比例配好的一抗，过夜，然后将玻片置于 PBS(pH 7.4)中洗涤 3 次后加二抗覆盖组织，DAPI 复染细胞核，最后封片，镜检，记录。

1.5.4蛋白免疫印迹：将股骨组织浸入液氮匀浆、离心、裂解、提取蛋白，进行蛋白浓度测定，根据蛋白定量结果，在电压80 V下使样品通过浓缩胶与分离胶至适当位置后转印至PVDF膜，将封闭后的膜分别加入对应的一抗工作液中，4 ℃反应过夜，使用1×TBST洗涤3次，洗净未结合的一抗，在室温、避光条件下放入二抗工作液中作用60 min，洗去二抗后进行显色与成像。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 骨密度检测

DEX 2.5 mg/kg组、DEX 5 mg/kg组、DEX 7.5 mg/kg组右侧胫骨骨密度较SHAM组骨密度均降低，DEX 2.5 mg/kg组较其他两组降低更为显著，差异具有统计学意义(P<0.01)。见图1。

2.2 病理组织学检测

病理组织学检测发现，SHAM组骨小梁较厚，排列紧密，分布均匀，未有断裂，与SHAM组相比DEX 2.5 mg/kg组、DEX 7.5 mg/kg组骨小梁变薄，排列较为稀疏，分布不均匀且有骨小梁断裂，DEX 2.5 mg/kg组变化较其他组最为显著。结合骨密度和病理组织学检测结果，我们认为DEX 2.5 mg/kg为地塞米松注射液诱导继发性骨质疏松的最佳造模剂量，后续实验将以这个剂量为造模最佳剂量进行研究。见图2。

2.3 免疫组织化学检测

采用免疫组织化学对SHAM组、DEX 2.5 mg/kg组的Leptin、VEGF蛋白表达进行检测发现，与SHAM组相比，DEX 2.5 mg/kg组大鼠Leptin、VEGF蛋白的表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4 蛋白免疫印迹

蛋白免疫印迹结果显示，与SHAM组相比，DEX 2.5 mg/kg组大鼠Leptin、VEGF蛋白的表达均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

GC的摄入是OP常见的继发原因，也是该病常见的医源性原因，其具体机制尚不清楚，有研究[16-17]表明，GC主要是通过抑制成骨细胞活性，延长破骨细胞寿命，减少骨形成，最终诱导OP的形成。在祖国医学中并没有GIOP病名，GIOP属于祖国医学中“骨痿”“骨痹”等范畴，《素问·痿论》提出“肾主身之骨髓…肾者，水脏，今水不胜火，则骨枯而髓虚，故足不住身，发为骨痿”。《素问·逆调论》认为“肾不生则髓不能满。”肾精不足致使骨髓生化乏源，形成骨痹。说明了肾虚可为骨痿、骨痹的发病原因，《黄帝内经》记载，肾为先天之本，在体为骨，主骨生髓；肝为魂之处，血之藏，筋之宗，若肝血不足，随之肾精虚损最终肝肾俱虚；脾为气血生化之源，后天之本，开窍于口，在体合肉，主四肢肌肉，若脾胃虚弱，气血化生乏源，则精血不足，无以养髓，继而肢体疼痛、痿弱，而最终导致OP，同时，现有研究显示，肌肉含量与OP发病率具有密切关系[18]，遂肝脾肾三脏均与GIOP密切相关[19]。此外，祖国医学认为GC为“药邪”，其性属阳，为辛温发散之物，易伤阴液，阴亏无以生阳，阴损及阳，阴阳失衡。因此药邪伤肾, 肾精亏虚是GIOP发生的根本病机[20]。并且长期摄入GC后，OP骨折风险也相应提高，停用糖皮质激素2～6个月后，骨折风险比继续使用者低29%[21]。

Leptin是一种能作用于局部和全身的、具有多种功能的激素，不仅能控制饱腹感，与骨量和矿物质密度有密切关系。有研究[22]表明，Leptin能够激活JAK/STAT信号与BMP-9发挥协同作用，共同促进骨髓间充质干细胞成骨分化。Bartell等[23]体内实验研究阐明给与大鼠皮下注射Leptin后能够促进骨生长，同时对血清OPG、骨钙素剂量的依赖性增加，也确证瘦素对骨的代谢作用使得骨生长增加。除能够促进成骨分化外，Leptin抑制人外周血单核细胞培养物中破骨细胞的生成，减少破骨细胞寿命[24-25]。

VEGF因诱导新血管生成已受到医学各科广泛关注，血管为骨组织提供氧气、营养、生长因子和激素，在骨形成中起着至关重要的作用，与骨修复关系是不可分割的。在OP领域VEGF与骨细胞的相互作用已成为大家关注的热点问题，Street等[26]通过实验分别从抑制成骨细胞凋亡、促进骨形成、修复骨损伤3个方面证实VEGF与骨形成之间的关系。此外Leptin从脂肪细胞分泌到血液系统，激活VEGF参与骨形成，促进成骨细胞分化已得到证实[9-10]。

本研究采用GIOP模型通过骨密度及病理组织学检测确证了DEX 2.5 mg/kg剂量组为造模的最佳有效剂量，为后续的实验探究奠定了坚实基础。在后续研究中我们采用免疫组织化学及蛋白免疫印迹检测SHAM组和DEX 2.5 mg/kg剂量组的股骨，从组织形态学及蛋白水平阐明DEX 2.5 mg/kg组较SHAM组Leptin、VEGF蛋白表达显著下降，证实了GC诱导的OP过程是通过抑制Leptin、VEGF蛋白表达，抑制血管生成及成骨分化发挥作用的。本研究为后续治疗GIOP药物的开发提供了可靠证据和新的思路，为糖皮质激素性骨质疏松的防治提供理论基础和科学依据。