右美托咪定对小鼠大脑皮层听性稳态反应的影响*

李金红 李子杰 王帅 秦岭

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一种α2受体激动剂，与常用的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)受体介导的麻醉剂机制不同。DEX的优点是具有镇静和镇痛作用的同时，不会引起呼吸抑制。DEX诱导镇静的另一个重要特性是患者易于唤醒[1]；正因为这一特性使DEX能够成为广泛应用于清醒的开颅手术等许多种治疗或诊断过程中重要的镇静剂[2]。然而DEX诱导的镇静作用对脑神经电活动影响尚不完全清楚。脑电图(EEG)是检查大脑电活动的客观指标，应用EEG检测由周期性声音刺激引起的伽马段(30～80 Hz)脑电振荡被称为听性稳态反应(ASSR)，它是评估中枢神经系统的感觉和认知功能的一种有效方法[3]。特别是40 Hz click-train诱发的伽马频段频率范围内的ASSR已广泛用于精神疾病的临床检查[4,5]和动物的神经药理实验[6,7]。ASSR也常被应用于监测临床麻醉过程中患者的觉醒程度[8]，然而，DEX对ASSR的影响仍然未知。本研究利用在体电生理记录方法，比较小鼠接受DEX腹腔注射前后大脑听皮层ASSR的变化，探讨大脑感觉中枢神经电活动与DEX诱导的镇静作用的相关性。

1 材料与方法

1.1实验动物 本实验选用8只6～8周龄C57BL/6小鼠(北京维通利华)。所有动物均在标准实验条件下繁殖饲养，动物可自由进食饮水。所有实验方案按中国医科大学动物保护和使用委员会的要求执行(IACUC伦理审查号：CMU2019126)。所有手术均在全身麻醉状态下进行。

1.2材料和仪器 1.27 mm 2*6双排直针排母(深圳市鹰嘴豆科技有限公司)；M1.0*L2.0螺丝钉(62513，深圳瑞沃德有限公司)；银丝电极(A-M Systems)；生理盐水(吉林省都邦药业股份有限公司)；右美托咪定(江苏恒瑞股份有限公司)；2%异氟烷(深圳瑞沃德有限公司)；4%水合氯醛(上海精析化工科技有限公司)；硫酸阿托品溶液(天津金耀药业有限公司)；抗生素(源叶生物)；牙科水泥(日进齿科材料有限公司)；小鼠脑立体定位仪(DW2000)；高速颅骨钻(78001，深圳瑞沃德有限公司)；多通道前置放大器(PBXPreamplifer)；扬声器(K701,AKG,奥地利)；D/A转换器(PCI-6052E，美国 National Instruments 公司)。

1.3实验方法

1.3.1电极植入 应用2%异氟烷对小鼠进行吸入麻醉，腹腔注射硫酸阿托品(0.1 mg/kg)抑制呼吸道腺体分泌。手术过程中时刻监测小鼠体温，应用温控电热毯使其维持在37 ℃左右。将小鼠固定在小鼠脑立体定位仪上，剪开皮肤，暴露颅骨前囟，根据Paxions &Watson脑图谱定位听皮层位置(AP:2.5～3.5 mm,ML:+3.5～4.0 mm,DV:-2～2.5 mm)，用骨钻在该位点钻孔，置入导管，用牙科水泥固定好导管后，再将银丝电极由导管植入到听皮层，同时在小脑处钻一个1 mm小孔拧入螺丝钉，将银丝电极紧密缠绕在螺丝钉上作为接地点，用牙科水泥对银丝电极进行固定。术后腹腔注射抗生素(头孢呋辛，30 mg/kg,连续注射3天)防止感染，待小鼠恢复1周后再进行电生理记录。

1.3.2电生理记录和声音刺激 小鼠恢复1周后，放入隔声屏蔽室内的记录箱(20 cm×20 cm×30 cm)中，将记录线与小鼠头部电极相连，每次15分钟，连续4天使小鼠适应记录环境，第5天开始记录。在自由清醒的条件下记录小鼠正常局部场电位(local field potential, LFP)8～10分钟后，腹腔注射DEX(80 μg/ kg，溶于0.9%NaCl溶液)；注射30 min后，再次重复记录小鼠LFP。应用click-train声刺激评估ASSR，单个click是持续时间为0.2 ms的矩形脉冲, click-train持续500 ms，频率为40 Hz。声刺激通过置于实验箱顶部的扬声器播放，强度调整为70 dB SPL；每个记录单元中，以2～5 s的随机间隔重复120 次。将微电极输出与前置放大器相连,由数字信号处理器接受前置放大器的输出后，通过带通滤波器提取0～300 Hz局部场电位(LFP)信号导入到MATLAB进行分析。

1.3.3电生理数据分析 使用基于短时傅里叶变换算法对click-train诱发的LFP进行时频分析，通过eeglab工具箱(https://sccn.ucsd.edu/eeglab/index.php)提供的多维窗方法计算得到平均能量(MTP)和锁相因子(PLF)。MTP是一次记录中120次声音刺激诱发的LFP在时域中能量的平均值，以声音刺激后与声音刺激前的比值表示(刺激后/刺激前)。PLF描述多次声音刺激中LFP在时间和频率上的相位一致性，将时频分析中每一个时间窗的结果标准化后进行平均，得到结果值位于0～1之间，0代表没有同步性，1代表完全同步。

1.4统计学方法 使用SPSS(18.0，2010。Chicago：SPSS，Inc。)进行统计分析，统计显著性确定为P<0.05，数据表示为平均值±标准误[9，10]。

2 结果

植入电极手术成功并符合电生理记录要求的C57BL/6小鼠共8只，共获得16次有效的神经电生理记录数据用于处理分析；其中2.1、2.2、2.3是同一只实验鼠的代表性结果，2.4中是8只实验鼠的统计分析结果。

2.1DEX对40 Hz click-train诱导的听皮层LFP的影响 自由清醒状态下，记录AC的LFP，在刺激开始时表现出较大的波动，随后在整个刺激期间出现清晰的振荡(ASSR，图1a)，而在腹腔注射DEX后，再次记录听皮层(AC)的LFP，发现LFP在click-trains刺激开始时仅显示出较弱的波动，并且同步性较差(图1b)。图1a和1b表示在DEX注射前后从AC记录的平均LFP的示例。为了研究声音刺激所诱发的脑电，使用35～45 Hz带通滤波器来分析LFP(图1c和1d)，可见在腹腔注射DEX后，40 Hz ASSR比DEX注射前更弱。

图1 DEX注射前后AC区记录的40 Hz click-train诱发LFP的平均值 给药前后AC区ASSR的代表性LFP波形图。a和b为未进行滤波的LFP; c和d为进行35～45 Hz的滤波后显示出40 Hz的LFP。顶部的垂直线代表click-train刺激

2.2DEX对多次重复记录的LFP一致性的影响 为了表明腹腔注射DEX前后声音刺激诱发的脑电反应一致性的影响，本研究分别将注射前后的120次LFP记录结果叠加绘制在同一图中(图2)。注射DEX前的LFP比注射后的LFP排列更为整齐，显示出较强的一致性。

图2 DEX注射前后LFP的一致性 给药前后AC区ASSR的代表性120次LFP记录的叠加结果图。a. DEX注射前诱发的120次LFP记录的叠加结果,其中白色正弦曲线为120次LFP记录结果的平均值; b. DEX注射后诱发的LFP

2.3DEX对ASSR的定量指标的影响 用MTP和PLF对DEX注射前后40 Hz click-train诱导的LFP进行定量评测(图3)。图3a显示了图1a中所列举的LFP的 MTP分析结果，可见其在40 Hz处呈现清晰的红色条带，说明40 Hz click-train在听皮层诱发出较强的ASSR反应;而其能量在DEX注射后明显降低(图3b),PLF的结果也显示出类似的趋势(图3c和d)。为了在DEX前后的结果之间进行统计比较，计算了所有测试动物的平均MTP和PLF。

图3 DEX注射前后ASSR的定量分析 给药前后AC区代表性MTP和PLF; a. 注射DEX前的MTP; b. DEX注射后的MTP; c. DEX注射前的PLF; d. DEX注射后的PLF

2.4DEX对ASSR统计结果的影响 在刺激时间窗口0～0.55 s以及35～45 Hz频率范围内对频谱时间函数中的值取平均值,图4显示了在8只实验鼠中记录的MTP和PLF的平均值和标准误。与DEX注射前相比，DEX注射后的MTP和PLF均显著降低(配对t检验Lt7=2.858，P<0.05；t7=2.507，P<0.05)。

图4 DEX注射前后ASSR的统计分析 a. DEX注射前后MTP的变化; b. DEX注射前后PLF的变化 (n=8,配对t检验,*表示P<0.05)

3 讨论

ASSR是一种大脑神经元对周期性声音刺激产生的同步电反应信号，这种诱发性脑电振荡信号与刺激信号的时间相位始终保持一致。临床常用的 MEG/EEG 方法都可以记录可靠的ASSR信号。

ASSR的起源尚无统一结论，大部分研究认为经皮脑电图记录的ASSR产生于大脑皮层，主要是初级和次级听觉皮层神经元，除此之外脑干和前脑等结构也对ASSR的产生有辅助作用[11]。为了测量更高精度的ASSR信号,有研究采用了LFP记录方法，通过植入于实验小鼠脑内AC区记录LFP可以直接反映出大脑皮层神经元的电活动状态，减少了肌肉收缩、动脉搏动等信号的干扰[12]。此前已有动物和人的研究，比较了10、20、40、80 Hz等不同频率声音刺激所诱发的ASSR,结果证实40 Hz声音刺激诱导的ASSR反应最强[13,14]，故本研究采用40 Hz 声音刺激。调幅声音(amplitude modulated, AM)和脉冲声音序列(click-train)是诱发ASSR的两种常用刺激类型;AM音是通过使用正弦波在时域对声音振幅进行调制，从而使声音的振幅随时间的变化而出现连续有节律的变化。Click-train刺激由时间短而频率广的脉冲音(click)组成,因此在频域上，AM音只有一个峰值而click-train音具有多个峰值。听皮层由不同的亚区构成，各亚区对声音刺激频率的反应敏感性不同,而AM音刺激的频率范围窄，只有较小的AC区域产生脑电反应；click作为广谱频率刺激会诱发较大范围的AC区产生脑电反应，使记录到的ASSR反应强度更强[12];所以本研究采用click-train刺激。

既往研究表明，ASSR是监测麻醉过程中觉醒状态的良好生物指标[15]。本研究结果进一步证明DEX等镇静剂也可以对ASSR产生抑制性作用。DEX是一种广泛使用的镇静剂，作用于α2受体，通过抑制蓝斑(LC)中去甲肾上腺素的释放，可以发挥镇静效果[16]。先前对自发性脑电图的研究发现，DEX引起的镇静作用可以诱发纺锤波振荡(12～15 Hz)的出现[1]，类似于非快速眼动(NREM)睡眠2期中常见的脑电波形[17]。纺锤波被认为起源于丘脑中的GABA能网状核[18]，DEX诱导纺锤波的产生可能因为DEX改变了LC到丘脑的投射。与纺锤波不同，伽马振荡与大脑皮层的高级认知活动有关，例如：感觉门控、注意力、知觉和运动控制等[19]。研究发现，DEX可以持续降低镇静和麻醉恢复期的自发脑电伽马振荡[1]。本研究结果进一步表明感觉刺激所诱发的伽马振荡也被DEX降低。与以前的研究相比，本研究有以下几个优势：①使用40 Hz click-train作为听觉刺激，诱发了AC中ASSR的可靠响应，ASSR具有更高的信噪比、相位一致性和可重复性；②整个记录过程包含100多次测试，历时仅8至10分钟，这更便于临床应用，特别适用于儿童和依从性较差的患者。

本研究通过对ASSR的定量分析，结果显示MTP和PLF在注射DEX后显著降低，提示ASSR可作为一种客观可靠的脑电生理指标来监测DEX的作用效果；但尚不清楚不同剂量下的DEX对ASSR的MTP和PLF的影响程度是否存在差异，有待后续研究。此外，ASSR的MTP和PLF降低，提示皮层神经元电活动的同步性被DEX干扰；先前的研究表明，皮层中有两种重要的神经元类型，即兴奋性神经元和快速放电的小清蛋白(PV)抑制性中间神经元，以及两种特定的受体类型，即γ-氨基丁酸受体(GABAA)的A亚型和谷氨酸能受体的NMDAR亚型，它们对于神经元电活动的同步性至关重要，并参与40 Hz ASSR的产生[15]。然而，仍然不清楚哪种类型的细胞和受体是DEX的主要靶标，需要在将来进一步研究和探讨。