硅胶柱层析纯化利普司他汀工艺研究

刘俊果，陈 敏，张 弘，吴立强

(1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.华北制药股份有限公司，河北 石家庄 050015；3.保定九孚生化有限公司，河北 保定 072150)

利普司他汀(结构式见图1)是由毒三素链霉菌发酵产生的一种次级代谢产物，具有胰脂肪酶抑制活性[1-2]，能有效减少脂肪的分解和吸收。利普司他汀的四氢衍生物奥利司他(Orlistat) 已被罗氏公司成功开发为减肥药赛尼可[3-4]，是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用而上市的治疗肥胖症的减肥药物[5-6]，在促进肥胖患者体重降低的同时能有效改善由肥胖症带来的心血管等疾病的困扰，且安全性和耐受性良好[7]。

图1 利普司他汀的结构式Fig.1 Structural formula of Lipstatin

硅胶柱层析法分离效果好，操作简单，易于实现工业化，是目前分离纯化一些生化产物的主流方法[8-9]，如白藜芦醇、平贝总碱等。作者从毒三素链霉菌的发酵液中获得利普司他汀粗品，采用硅胶柱层析法对利普司他汀相品进行分离纯化，考察洗脱剂配比、洗脱体积、洗脱流速、载样量等参数[10-11]对利普司他汀纯度和回收率的影响，以期为利普司他汀的分离纯化研究提供理论依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

利普司他汀粗品(色谱纯度66.917%)，自制。

正庚烷、丙酮，分析纯，天津永大化学试剂有限公司；乙腈，色谱纯，Fisher Chemical；甲酸，色谱纯，鹏发化工有限公司；蒸馏水，自制。

LC-PDA型高效液相色谱仪，岛津企业管理(中国)有限公司；KQ-250B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；玻璃层析柱(Φ45 mm×200 mm)。

1.2 湿法装柱

硅胶活化：取60 g硅胶(120目)，于120 ℃烘箱中干燥0.5 h，加入正庚烷充分搅拌均匀，常温下浸泡2 h，备用。

装柱和平衡：在层析柱内加入高约 100 mm的正庚烷，打开阀门使之缓慢流出，充分润洗柱子；将活化好的硅胶搅拌均匀，超声10 min，沿玻璃棒一次性转入层析柱内，自然沉降，并用橡胶锤轻敲柱壁，赶走气泡，装实硅胶；在层析柱上层塞一团脱脂棉，防止上样时冲坏硅胶表面；用正庚烷淋洗至柱平衡。

1.3 硅胶柱层析纯化

称取一定量的利普司他汀粗品，用无水正庚烷溶解，配制成浓度为250 g·L-1的样品溶液，均匀加入层析柱中，加入洗脱剂进行柱层析，收集洗脱液；60 ℃下减压蒸馏浓缩回收洗脱剂，浓缩物用甲醇定容，采用HPLC法测定洗脱液中利普司他汀的纯度及回收率。分别考察洗脱剂配比、洗脱体积、洗脱流速及载样量对利普司他汀的纯度及回收率的影响。

2 结果与讨论

2.1 利普司他汀粗品除油相后的杂质分析

利普司他汀粗品用乙腈除油相后蒸干溶剂，溶解并过滤后进行HPLC分析，结果如图2所示。

图2 利普司他汀粗品除油相后的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectrum of crude Lipstatin after oil phase removal

由图2可知，利普司他汀是极性较弱的物质，杂质1#～9#先于利普司他汀主峰出峰，说明其极性弱于利普司他汀；杂质10#～12#后于利普司他汀主峰出峰，说明其极性强于利普司他汀。杂质1#～12#的相对保留时间分别为0.24、0.28、0.40、0.50、0.69、0.71、0.75、0.82、0.95、1.10、1.20、1.50，含量分别为1.221%、1.383%、1.252%、1.320%、0.977%、1.704%、14.989%、1.271%、0.578%、0.055%、2.467%、0.807%。利普司他汀粗品用乙腈除油相后的纯度为66.917%，即为硅胶柱层析上样的纯度。

2.2 洗脱剂配比的确定

根据利普司他汀的极性、溶剂沸点、后续溶剂回收等，选取丙酮-正庚烷作为洗脱剂。用1 BV正庚烷平衡层析柱，然后按3%的载样量(以硅胶质量计，下同)慢慢且均匀加入样品溶液，上样结束后分别用6 BV的5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷、15%丙酮-正庚烷、20%丙酮-正庚烷、30%丙酮-正庚烷洗脱，洗脱流速为1 BV·h-1，收集洗脱液，采用HPLC法测定洗脱液中利普司他汀的纯度及回收率，结果如图3所示。

图3 洗脱剂配比对利普司他汀层析效果的影响Fig.3 Effect of eluent ratio on chromatography effect of Lipstatin

由图3可知，以5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷为洗脱剂时，洗脱液中利普司他汀的纯度和回收率均较低，大部分利普司他汀吸附于硅胶上，没有被完全洗脱下来；以15%丙酮-正庚烷为洗脱剂时，利普司他汀纯度为80.358%，回收率为81.88%；继续增加丙酮比例，利普司他汀的纯度逐渐降低，回收率逐渐升高，虽然以30%丙酮-正庚烷为洗脱剂时，利普司他汀回收率高达92.00%，但更多的杂质也随之被洗脱下来，导致纯度仅为66.266%。综合考虑，选择15%丙酮-正庚烷洗脱利普司他汀组分。

2.3 洗脱体积及洗脱曲线

由2.1可知利普司他汀粗品除油相后有弱极性杂质存在，根据2.2洗脱结果，可先分别用1 BV的5%丙酮-正庚烷、10%丙酮-正庚烷洗脱非极性及弱极性杂质；然后用7 BV的15%丙酮-正庚烷洗脱硅胶柱上的利普司他汀组分，直至把大部分利普司他汀洗脱下来；最后用2 BV的30%丙酮-正庚烷洗脱强极性杂质。按2.2条件上样，按上述程序梯度洗脱，洗脱流速为1 BV·h-1，然后按1 BV 1个馏分分段收集洗脱液，采用HPLC法测定洗脱液中利普司他汀的纯度及回收率，洗脱曲线如图4所示。

图4 利普司他汀的洗脱曲线Fig.4 Elution curve of Lipstatin

由图4可知，馏分1和2洗脱出来的大部分是非极性或弱极性杂质，硅胶上依旧吸附大量的利普司他汀；馏分3洗脱出极少量的利普司他汀，为洗脱过渡段；馏分4将部分利普司他汀洗脱下来；馏分5、6的洗脱量最大，将大部分利普司他汀洗脱下来；馏分7～9的洗脱量减少，只将残留的利普司他汀洗脱下来。馏分4～8中利普司他汀的纯度及回收率呈先升高后降低的趋势，且纯度较高，说明利普司他汀主要是由15%丙酮-正庚烷洗脱剂洗脱下来的；馏分9～11中利普司他汀的纯度及回收率迅速降低，说明层析柱中硅胶吸附的利普司他汀绝大部分已经被洗脱下来，后续主要是由30%丙酮-正庚烷洗脱剂洗脱极性较强的杂质。表明，上述梯度洗脱程序能较好地分离利普司他汀。在馏分接收过程中，将馏分 1～3合并，为弱极性组分段；馏分4～8合并，为利普司他汀组分段；馏分9～11合并，为较强极性组分段。

2.4 洗脱流速的确定

按2.3洗脱条件，保持其它条件不变，分别以洗脱流速0.5 BV·h-1、0.75 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1洗脱，分段收集，合并馏分4～8，采用HPLC法测定洗脱液中利普司他汀的纯度及回收率，结果如图5所示。

图5 洗脱流速对利普司他汀纯度及回收率的影响Fig.5 Effect of elution flow rate on purity and recovery of Lipstatin

由图5可知，洗脱流速为0.5 BV·h-1时，利普司他汀的纯度及回收率均较低，且分离时间较长，分离效果较差；而洗脱流速为1.5 BV·h-1时，由于流速过快使两相间的浓度难以分配平衡，分离效果也不理想；虽然洗脱流速为0.75 BV·h-1、1.0 BV·h-1时，纯度相差不大，但1.0 BV·h-1的洗脱流速可能较快，导致洗脱量较少，回收率较低。综合考虑，选择洗脱流速为0.75 BV·h-1。

2.5 载样量的确定

在硅胶柱层析分离的工业生产中，在保证纯化效果的基础上一般选用最大的载样量。分别选用1%、3%、5%、10%的载样量，洗脱流速为0.75 BV·h-1，其它条件不变，采用HPLC法测定洗脱液中利普司他汀的纯度及回收率，结果如图6所示。

由图6可知，载样量为1%时，利普司他汀的纯度及回收率均较低，且上样量过低造成硅胶及洗脱剂的浪费；载样量为3%、5%时，能够较好地分离纯化利普司他汀，但与3%载样量相比，5%载样量时的纯度较低；而载样量为10%时，由于超出了硅胶的负荷量，不能将大部分利普司他汀洗脱下来，导致纯度及回收率均较低。综合考虑，选择载样量为3%。

图6 载样量对利普司他汀纯度及回收率的影响Fig.6 Effect of loading amount on purity and recovery of Lipstatin

2.6 硅胶柱层析纯化前后的杂质分析

将2.3中收集的馏分4～8合并，过滤后进行HPLC分析，结果如图7所示。

图7 硅胶柱层析纯化后利普司他汀的HPLC图谱Fig.7 HPLC spectrum of Lipstatin purified by silica gel column chromatography

由图7可知，杂质1#、2#、3#、4#、5#、7#、8#、9#、11#、12#的相对保留时间分别为0.24、0.28、0.40、0.50、0.69、0.75、0.82、0.95、1.20、1.50，含量分别为0.191%、0.163%、1.202%、0.298%、2.020%、4.357%、1.546%、0.578%、0.239%、0.772%。

利普司他汀属于酯类物质，通过硅胶柱层析法可去除微生物代谢过程中产生的水溶性和脂溶性色素。与硅胶柱层析前利普司他汀除油相后的HPLC图谱相比较，经硅胶柱层析纯化后，杂质1#、2#、3#、4#、7#、9#能部分去除，杂质5#、8#有所增加，杂质6#、10#能完全去除，除杂效果显著，利普司他汀纯度达到80.499%。

3 结论

采用硅胶柱层析法对利普司他汀粗品进行分离纯化，确定最佳纯化工艺条件如下：以120目硅胶为固定相，依次用1 BV 5%丙酮-正庚烷、1 BV 10%丙酮-正庚烷、7 BV 15%丙酮-正庚烷、2 BV 30%丙酮-正庚烷梯度洗脱，洗脱流速为0.75 BV·h-1，载样量为3%，收集7 BV 15%丙酮-正庚烷的洗脱液。在此条件下，利普司他汀纯度可达80.499%。该工艺除杂效果明显，有利于后续工序分离纯化得到高纯度的利普司他汀。