圆滑番荔枝抑菌活性成分分离

苟亚峰 孙世伟 高圣风 孟倩倩 王政 刘爱勤

摘  要  为进一步分离圆滑番荔枝中抑菌活性成分，以胡椒瘟病菌为供试病原菌，采用硅胶层析柱对圆滑番荔枝叶乙醇提取物中抑菌活性成分进行了初步分离。结果表明：从圆滑番荔枝叶乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中分离得到的D1、D2、D3、....D10等10种馏分中D1、D4、D5、D7、D8对胡椒瘟病菌具有抑菌活性，抑菌率分别达到了68.10%、65.95%、63.44%、76.34%和50.18%。对D1组分进一步分离得到D1-1纯化合物，通过核磁共振氢谱、碳谱确定其为棕榈酸酰胺。本研究为进一步研制防治胡椒瘟病的植物源杀菌剂提供依据。

关键词  圆滑番荔枝 ;胡椒瘟病菌 ;馏分 ;抑菌活性

中图分类号   文献标识码  A    Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.11.005

Isolation of Antifungal Activity of Annona glabra

GOU Yafeng1，2）  SUN Shiwei1，2）  GAO Shengfeng1，2）

MENG Qianqian1，2）  WANG Zheng1，2）  LIU Aiqin1，2）

（1 Research Institute of Spice and Beverage Crops，CATAS，Wanning， Hainan 571533;

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and

Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops，Wanning，Hainan 571533）

Abstract  Annona glabra was extracted with ethanol and its components with antifungal activity were isolated by column chromatography with Phytophthora capsici as test pathogen. The results showed that 10 components with antifungal activity were isolated from the ethanol extract， of which components D1， D4， D5， D7 and D8 had inhibitory effect on Phytophthora capsici， and their inhibition rates were 68.10%， 65.95%， 63.44%， 76.34% and 50.18%， respectively. The component D1 was isolated further to produce pure compound D1-1 which was determined as palmitamide by using hydrogen spectrum and carbon spectrum in nuclear magnetic resonance. This study provided evidence for the further development of botanic fungicides against phytophthora foot rot of black pepper.

Keywords  Annona glabra ; Phytophthora capsici ; fraction ; antifungal activity

從天然产物，特别是从植物体中发现农药活性物质，直接利用其原材料创制新农药，或者从天然产物中寻找先导化合物，是近年来新农药创制的主要途径。张兴等[1]报道植物源农药除了防治有害生物以外，还表现出明显的肥效、增产作用，同时在调节作物生长、提高植物免疫、抗逆以及产品保鲜方面亦具有明显功效。近年来，植物源杀菌剂的研发有了较大进展。

圆滑番荔枝（Annona glabra Linn.）是番荔枝科（Annonaceae）番荔枝属（Annona）植物，常绿乔木。原产热带美洲，现亚洲热带地区也有栽培。我国云南、广西、广东、浙江、台湾和海南等省均有栽培[2]。有研究报道，番荔枝科植物含有生物碱、萜类、黄酮、番荔素、多氧环己烯和苯乙烯内酯等成分，具有驱虫、抗病毒、杀虫、抗癌等多种生理活性[3-4]。对该属植物活性筛选发现，圆滑番荔枝有较强的抑制肿瘤的生理活性。苟亚峰等[5-6]研究报道了圆滑番荔枝乙醇提取物乙酸乙酯萃取物对胡椒瘟病菌菌丝生长具有较好的抑制作用。因此，本试验以胡椒瘟病菌为供试病原菌，采用活性跟踪法[7]分离圆滑番荔枝叶乙醇提取物中抑菌活性成分，为进一步研制防治胡椒瘟病的植物源杀菌剂提供依据。

1  材料与方法

1.1  试材

圆滑番荔枝叶采自中国协和医学科院药用植物研究所海南分所院内。将新鲜的圆滑番荔枝叶充分阴干，粉碎后置通风、避光处储藏备用。

胡椒瘟病菌（Phytophthora capsici）由中国热带农业科学院香料饮料研究所病虫害防控研究室提供。

1.2  方法

1.2.1  乙醇提取物的制备

采用冷浸法：准确称取5 kg的圆滑番荔枝叶干粉装入广口瓶中，加入干粉5倍量的乙醇分别浸提72、48和24 h后过滤，每个处理3次重复，合并3次滤液并减压浓缩，获得圆滑番荔枝叶乙醇提取物浸膏857.50 g，放置于4℃冰箱内备用。

1.2.2  乙酸乙酯萃取组分的制备

采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯等3种不同极性溶剂对1.2.1中制备的乙醇提取物浸膏进行依次萃取，合并萃取液并浓缩后分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯的萃取组分，放置于4℃冰箱内备用。

1.2.3  抑菌活性成分分离

通过生物活性跟踪法[7]，采用硅胶层析柱，对圆滑番荔枝乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中抑菌活性成分进行分离纯化。具体方法如下：将大孔树脂湿法装柱，用适量的溶剂溶解40 g乙酸乙酯萃取组分，上样，依次用体积比石油醚∶二氯甲烷[3∶1、 1∶1和0∶1]，二氯甲烷∶甲醇[200∶1、 100∶1、 50∶1、30∶1、20∶1、10∶1和1∶1]为洗脱剂进行梯度洗脱。每一个梯度分别洗脱1 500 mL，以200 mL为单位接收流出液，根据薄层色谱点板反洗和单质碘显色结果，合并相近组分，得到不同馏分。

1.2.4  抑菌活性测定

以胡椒瘟病菌为供试病原菌，测定各馏分的抑菌活性，具体参照菌丝生长速率法[8-9]测定分离的化合物对胡椒瘟病菌的抑菌活性。根据样品量和活性选择其中一个抑菌活性较强的馏分继续进行分离：先经硅胶柱层析分离，然后用石油醚∶乙酸乙酯体积比0∶1、5∶1洗脱，获得白色固体经重结晶得到化合物。

1.2.5  化合物结构鉴定

对分离得到的化合物通过熔点及TLC检测、氢谱（1H-NMR）、碳谱（13C-NMR）等谱图数据分析并结合文獻，确定化合物结构。

2  结果与分析

2.1  各馏分抑菌活性测定

对圆滑番荔枝乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中抑菌活性成分进行分离纯化，获得10个馏分（D1～D10），参照1.2.4的方法，测定这10个馏分对胡椒瘟病菌的抑菌活性，结果见表1。

从表1中可以看出，D1、D4、D5、D7、D8对胡椒瘟病菌的抑菌率均达到了50%以上，分别是68.10%、65.95%、63.44%、76.34%和50.18%，D1和D7的抑菌活性较高，其抑菌活性成分有待进一步分离。

2.2  对D1馏分分离的化合物进行初步鉴定

将D1（1.87 g）经硅胶柱层析分离，用石油醚∶乙酸乙酯体积比0∶1、5∶1洗脱，得白色固体经重结晶得到化合物D1-1。通过核磁共振谱（1H-NMR和13C-NMR）初步鉴定分离的化合物D1-1结构，D1-1为白色蜡状固体，1H-NMR （400 MHz，CDCl3）：δ 2.38 （t，J=7.4 Hz，2H），1.60-1.52 （m，2H），1.32-1.21 （m，24H），0.88 （t，J=6.7 Hz，3H）;13C-NMR （101 MHz，CDCl3）：δ 173.4，42.8，31.9，29.8，29.7，

29.6，29.5，29.4，29.3，29.2，23.9，22.7，14.1，根据已发表数据[10]，D1-1鉴定为棕榈酸酰胺（谱图见图1、2），分子式为CH3（CH2）14COONH2。

3  讨论与结论

田丽娟等[11-13]对圆滑番荔枝的化学成分进行了分析，分离得到二萜类和生物碱类化合物。本研究从圆滑番荔枝叶乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中分离得到的10种馏分D1、D2、D3、...D10中D1、D4、D5、D7、D8对胡椒瘟病菌抑菌率分别达到了68.10%、65.95%、63.44%、76.34%和50.18%。对D1组分进一步分离得到D1-1纯化合物，通过核磁共振氢谱、碳谱确定其为棕榈酸酰胺，与孙兰等[10]从圆滑番荔枝种子中分离得到棕榈酸酰胺的结果是一致的。但棕榈酸酰胺是从圆滑番荔枝叶乙醇提取物乙酸乙酯萃取组分中的低极性馏分中分离得到的，其抑菌活性还有待进一步研究。

有关圆滑番荔枝活性研究主要集中在医药上。姜盼等[14]综述了圆滑番荔枝的化学成分及生物活性研究进展，为进一步对其药用价值的开发奠定基础。张永红等[15]从圆滑番荔枝中分离得到2种二萜类化合物，并标明该2种化合物对肿瘤具有较好的抑制作用，有望开发为新的抗肿瘤药物。国外也有圆滑番荔枝作为传统药物被用于防治包括癌症在内的人类疾病报道。Curtis Bruce等[16]报道，与抗癌药物阿霉素相比，圆滑番荔枝种子酒精提取物明显降低了细胞毒素水平，增加了细胞内柔红霉素积累。但目前对圆滑番荔枝抑菌作用方面的研究国内外尚未见相关报道。因此，其抑菌作用有待进一步研究。

参考文献

[1] 张  兴，吴志凤，李  威，等. 植物源农药研发与应用新进展[J]. 农药科学与管理，2013，34（4）：24-31.

[2] 中国科学院中国植物志编委会. 中国植物志[M]. 北京：科学出版社，2004：170.

[3] 李艳芳，符立梧.番荔枝内酯抗肿瘤作用研究进展[J]. 中国药理学通报，2004，20（3）：245-247.

[4] 朱  峰，刘晓红，丁健华，等. 番荔枝活性化学成分研究进展[J]. 仲恺农业技术学院学报，2007，20（4）：62-70.

[5] 苟亚峰，刘爱勤，孙世伟，等. 23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J]. 植物保护，2010，36（6）：128-131.

[6] 苟亚峰，孙世伟，高圣风，等. 圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性测定[J]. 热带农业科学，2014，34（4）：1-3.

[7] 杨震发，袁呈山，杨顺义. 黄花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究[J]. 植物保护，2014，40（6）：59-64.

[8] 方中达. 植病研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1998.

[9] 慕立义. 植物化学保护研究方法[M]. 北京：中国农业出版社，1994：79-81.

[10] 孙  兰，朱久香，余竞光，等. 圆滑番荔枝种子化学成分研究[J]. 药学学报，2003，38（1）：32-36.

[11] 田丽娟，韩  英，孟正木，等. 圆滑番荔枝的化学成分研究[J]. 中国药科大学学报，2001，32（1）：10-12.

[12] 田丽娟，杨念云，孟正木，等. 圆滑番荔枝的化学成分研究[J]. 中国药学杂志，2003，38（4）：258-260.

[13] 常世忠，张笑松，方  薇. 圆滑番荔枝的化学成分研究[J]. 安徽医药，2002，6（1）：14.

[14] 姜  盼，陈  锴，程宝奇，等. 圆滑番荔枝的化学成分及生物活性研究进展[J]. 中草药，2011，42（12）：2 564-2 570.

[15] Yonghong Zhang， Haiyan Peng， Guohao Xia， et al. Anticancer effect of two diterpenoid compounds isolated from Annona glabra Linn[J]. Acta Pharmacol Sin， 2004， 25（7）： 937-942.

[16] Curtis Bruce Cochrane， P.K. Raveendran Nair， Steven J.Melnick，et al. Anticancer effects of Annona glabra plant extracts in human Leukemia Cell Lines[J]. Anticancer research， 2008（28）： 965-972.