Box-Behnken响应面法结合熵权法优化千金子二萜醇酯类成分的闪式提取工艺

王佩华，张桂梅，王慧楠，杨子烨，陈梦雨，姜明瑞，岳珠珠，王志成，张婧秋，王英姿

(北京中医药大学中药学院，北京102488)

千金子为大戟科植物续随子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟种子[1]，含有脂肪油、二萜、甾醇、黄酮、香豆素、挥发油等多种化学成分[2]。二萜醇酯类化合物是其主要活性成分，具有泻下逐水、祛斑美白、抗炎镇痛、抗肿瘤等多种药理作用，其中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3是含量相对较高且具有显著药理活性的二萜醇酯类成分[3-4]。千金子二萜醇酯类成分的传统提取方法主要有回流提取法、冷浸提取法和超声提取法等，这些方法存在有效成分富集效率低、试剂用量大、耗时繁琐等缺点[5-7]。而闪式提取法具有提取快速、无需加热、有效成分损失少等优点，广泛适用于中药根、茎、叶、花、果实、种子等的提取[8-9]，目前未见闪式提取千金子二萜醇酯类成分的报道。

响应面法是一种综合实验设计和数学建模的优化方法，将因素与指标的相互关系用多元二次回归多项式方程近似拟合，可有效指导工艺参数的优化[10-11]。熵权法是一种确定指标权重的客观赋权法，可用于确定多指标评价系统中各指标权重[12-13]。2020版《中华人民共和国药典》对千金子中千金子甾醇(即千金子素L1)的含量进行了规定[1]，因此，作者选用千金子中主要的二萜醇酯类成分千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3为指标成分，以料液比(g∶mL，下同)、提取时间、提取电压为考察因素，通过Box-Behnken响应面法结合熵权法对千金子二萜醇酯类成分的闪式提取工艺进行优化，以期为千金子二萜醇酯类成分的提取提供新的思路。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

千金子药材，购自安徽亳州，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为大戟科植物续随子(EuphorbialathyrisL.)的干燥成熟种子。

千金子素L1对照品(批号111789-200901)、千金子素L2对照品(批号111790-200901)、千金子素L3对照品(批号111791-200901)，纯度均大于98%，中国药品生物制品检定所；甲醇，质谱纯，Fisher公司；乙醇，化学纯，北京虹湖联合化工产品有限公司。

闪式提取器，北京金鼎科技发展有限公司；高效液相色谱仪，美国Thermo Fisher；KH7200DB型数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；BSI10型万分之一电子天平，德国Sartorius。

1.2 千金子二萜醇酯类成分的提取

精密称取一定量的千金子加入闪式提取器中，在一定条件下提取，减压抽滤，收集滤液，转移至1 000 mL容量瓶中定容至刻度，即得提取液。

1.3 千金子二萜醇酯类成分含量的测定

1.3.1 对照溶液的配制

分别精密称取千金子素L1对照品5.13 mg、千金子素L2对照品5.12 mg、千金子素L3对照品5.08 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL容量瓶中，摇匀，即得1.026 mg·mL-1千金子素L1、1.024 mg·mL-1千金子素L2、1.016 mg·mL-1千金子素L3的对照储备液，临用前用甲醇稀释成相应浓度的对照溶液。

1.3.2 供试溶液的配制

精密量取提取液0.5 mL，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，取续滤液作为供试溶液。

1.3.3 色谱条件

ODS-3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱程序：0～5 min，75%A；5～35 min，75%～70%A；35～45 min，70%～85%A；45～60 min，85%～90%A；60～65 min，90%～75%A；检测波长275 nm；流速1 mL·min-1；柱温25 ℃；进样量20 μL。

各对照溶液及供试溶液的HPLC图谱如图1所示。

图1 千金子素L1对照溶液(a)、千金子素L2对照溶液(b)、千金子素L3对照溶液(c)及供试溶液(d)的HPLC图谱Fig.1 HPLC spectra of standard solution of euphorbia factor L1(a),euphorbia factor L2(b) and euphorbia factor L3(c)，and test solution(d)

1.4 响应面实验

根据前期预实验及单因素实验结果，使用Design-Expert 10.0软件进行Box-Behnken设计，以料液比、提取时间、提取电压为考察因素，以提取液中千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3通过熵权法计算的综合评分(Y)为响应值。响应面实验的因素与水平如表1所示。

表1 响应面实验的因素与水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.5 综合评分的计算

采用熵权法计算指标的权重，先将各指标的数据进行标准化处理，根据公式(1)计算第j个指标的信息熵Ej，根据公式(2)计算j指标的权重Wj，再根据公式(3)计算j指标的综合评分Y。

(1)

(2)

Y=千金子素L1的提取率×千金子素L1的权重+千金子素L2的提取率×千金子素L2的权重+千金子素L3的提取率×千金子素L3的权重

(3)

2 结果与讨论

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系

分别精密移取适量各对照储备液，加甲醇稀释成6个浓度的对照溶液，按1.3.3色谱条件进样分析。以对照溶液浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)绘制标准曲线，拟合结果如表2所示。

表2 千金子素L1、千金子素L2 、千金子素L3的线性关系Tab.2 Linear relationships of euphorbia factor L1,euphorbia factor L2，and euphorbia factor L3

由表2可知，各成分在相应浓度范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度

精密移取千金子素L1对照储备液1.500 mL、千金子素L2对照储备液0.625 mL、千金子素L3对照储备液1.250 mL于5 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，得0.308 mg·mL-1千金子素L1、0.128 mg·mL-1千金子素L2、0.254 mg·mL-1千金子素L3的混合对照溶液，按1.3.3色谱条件连续进样6次，测得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面积的RSD值分别为0.26%、1.20%、1.08%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 重复性

取同一供试溶液6份，按1.3.3色谱条件进样分析，测得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均提取率分别为0.49%、0.19%、0.43%，RSD值分别为1.90%、2.55%、1.23%，表明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性

取同一供试溶液，分别室温放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后，按1.3.3色谱条件进样分析，测得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3峰面积的RSD值分别为0.30%、0.29%、0.20%，表明供试溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 加标回收率

取已知含量的供试溶液6份各0.25 mL，按千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3含量的100%水平精密加入混合对照溶液0.25 mL，按1.3.2方法制备供试溶液，按1.3.3色谱条件进样分析，测得千金子素L1、千金子素L2、千金子素L3的平均加标回收率分别为103.22%、98.33%、97.76%，RSD值分别为1.22%、0.75%、1.14%，表明该方法准确度良好。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 Box-Behnken响应面实验设计及结果(表3)

表3 Box-Behnken响应面实验设计及结果Tab.3 Design and results of Box-Behnken response surface methodologies

2.2.2 回归模型方程与方差分析

通过Design-Expert 10.0软件对表3中的综合评分进行多元二次回归拟合，得回归模型方程：Y=-5.36757+0.20140A+0.027576B+0.066837C+0.00741401AB-0.000814960AC-0.000461503BC-0.00409654A2-0.013082B2-0.000210412C2。对回归模型进行方差分析，结果如表4所示。

表4 回归模型的方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model

2.2.3 响应面交互作用分析

利用Design-Expert 10.0软件根据模型绘制各因素交互作用对综合评分影响的响应面图与等高线图，如图2所示。

响应面和等高线可以直观形象地反映各因素的交互作用，响应面越陡峭，说明两因素的交互作用越显著[15]；等高线的形状越趋于椭圆说明交互作用越显著，越趋于圆形说明交互作用越不显著[16]。由图2可知，料液比与提取电压的响应面最陡峭，且等高线呈椭圆形，表明料液比与提取电压的交互作用对千金子二萜醇酯类成分提取率的影响最显著；其次是料液比与提取时间的响应面较陡峭，表明料液比与提取时间的交互作用对千金子二萜醇酯类成分提取率有一定程度的影响；而提取时间与提取电压的响应面最平缓，表明提取时间与提取电压的交互作用对千金子二萜醇酯类成分提取率的影响不显著。

图2 各因素交互作用对综合评分影响的响应面图与等高线图Fig.2 Response surface plots and contour plots for effect of interaction between each factor on comprehensive score

根据Design-Expert 10.0软件优化分析得到千金子二萜醇酯类成分的最佳闪式提取工艺为：料液比1∶14.021(g∶mL)、提取时间2.5 min、提取电压128.932 V，此条件下，3种二萜醇酯类成分提取率综合评分的预测值为0.396。

2.2.4 最佳工艺的验证实验

由于仪器精度等条件的限制，将最佳闪式提取工艺调整为：料液比1∶14(g∶mL)、提取时间2.5 min、提取电压130 V，进行3次验证实验，得到3种二萜醇酯类成分提取率综合评分的平均值为0.370(RSD=0.412%)，证明该模型选择合理，实验结果理想。

3 结论

采用Box-Behnken响应面法结合熵权法对千金子二萜醇酯类成分的闪式提取工艺进行优化，确定最佳提取工艺为：料液比1∶14(g∶mL)、提取时间2.5 min、提取电压130 V，在此条件下，3种二萜醇酯类成分提取率的综合评分为0.370，与模拟预测值(0.396)接近。闪式提取方法简便、节能、省时，可应用于千金子主要二萜醇酯类成分的快速提取，对二萜醇酯类成分的深入研究及千金子的开发利用具有十分重要的意义。