新型稠杂环类尿酸转运蛋白1抑制剂的合成及活性评价

谢福佳，王 伟，钟 健，周志慧，方志杰

(1.南京理工大学，江苏 南京 210094；2.江苏正大清江制药有限公司，江苏 淮安 223001)

尿酸转运蛋白1(URAT1)抑制剂可以抑制尿酸的重吸收、促进尿酸排泄[1-4]。已上市的URAT1抑制剂,如苯溴马隆[5-6]、雷西纳德(Lesinurad)[7]具有比较严重的副作用,研究人员开发了新一代的URAT1抑制剂Verinurad。

通过分析URAT1抑制剂相关的研究文献[8-13]，对比Lesinuard和Verinurad结构(图1)，发现2个化合物均存在硫代乙酸和芳香杂稠环结构，这2部分共同构成了药物的药效基团。作者以Verinurad为母核结构，对其进行结构修饰，设计了5个化合物(图2)，通过2-甲基-2-(((6-三氟甲基)喹啉-4-基)硫代)丙酸乙酯(Ⅰ)和2-((3-(4-氯苯基)哌啶-4-基)硫代)-2-甲基丙酸乙酯(Ⅱ)(化合物Ⅰ和Ⅱ合成方法参考文献[14-15])与醇胺进行酰化反应获得，考察延长硫代支链、改变杂环结构对化合物体外抑制活性的影响。目标化合物的合成路线见图3。

图1 Lesinurad 和Verinurad的结构式Fig.1 Structural formulas of Lesinurad and Verinurad

图2 经Verinurad结构修饰的目标化合物的结构式Fig.2 Structural formulas of target compourd by modification of Verinurad

图3 目标化合物的合成路线Fig.3 Synthetic route of target compound

1 实验

1.1 试剂与仪器

2-甲基-2-(((6-三氟甲基)喹啉-4-基)硫代)丙酸乙酯(Ⅰ，纯度>97%)、2-((3-(4-氯苯基)哌啶-4-基)硫代)-2-甲基丙酸乙酯(Ⅱ，纯度>97%)，江苏正大清江制药有限公司；胎牛血清(批号10099141)、DMEM培养基(批号10564)、胰蛋白酶(批号25200056)、G418(批号ant-gn-5)、磷酸缓冲液(批号14190250)、青霉素-链霉素(批号15070-063)，Invitrogen；14C-尿酸(批号ARC0513-250UCI)，ARC；二甲基亚砜(DMSO，批号D2650)，Sigma；苯溴马隆(Cat.No.3562-84-3)，百灵威科技；葡萄糖酸钠(Cat.No.527-07-1)、葡萄糖酸钾(Cat.No.299-27-4)、葡萄糖酸钙(Cat.No.299-28-5)，阿拉丁；其余所用试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

C-MAG HS7型数显磁力加热搅拌器，IKA；Agilent 1200LC/6110MS型液相色谱-质谱仪，安捷伦科技有限公司；Bruker AVANCE Ⅲ 500MHz UltraShield-PlusTM型全数字化核磁共振波谱仪，瑞士Bruker公司；MicroBeta2微孔板计数器，PerkinElmer公司。

1.2 化合物的合成

1.2.1 化合物TF-001的合成

将化合物Ⅰ(0.5 g，1.46 mmol)、2 mL乙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 mL 1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7(DBU)作为催化剂，升温至75～85 ℃加热反应4～5 h，粗品进行柱层析(二氯甲烷和甲醇洗脱)，得到黄色固体120 mg，收率23.0%。

1.2.2 化合物TF-002的合成

将化合物Ⅰ(0.5 g，1.46 mmol)、2 mL丙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 mL DBU作为催化剂，升温至75～85 ℃加热反应4～5 h，粗品进行柱层析(二氯甲烷和甲醇洗脱)，得到黄色油状液体140 mg，收率26.0%。

1.2.3 化合物TF-003的合成

将化合物Ⅰ(0.5 g，1.46 mmol)、2 mL二乙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 mL DBU作为催化剂，升温至75～85 ℃加热反应4～5 h，粗品进行柱层析(二氯甲烷和甲醇洗脱)，得到白色油状液体121 mg，收率20.6%。

1.2.4 化合物TF-004的合成

将化合物Ⅱ(0.5 g，1.49 mmol)、2 mL乙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 g叔丁醇钾作为催化剂，升温至75～85 ℃加热反应4～5 h，粗品进行柱层析(二氯甲烷和甲醇洗脱)，得到淡黄色固体160 mg，收率30.4%。

1.2.5 化合物TF-005的合成

将化合物Ⅱ(0.5 g，1.49 mmol)、2 mL丙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 g叔丁醇钾作为催化剂，升温至75～85 ℃加热反应4～5 h，粗品进行柱层析(二氯甲烷和甲醇洗脱)，得到淡黄色固体120 mg，收率21.8%。

1.3 化合物的活性评价

1.3.1 溶液的配制和培养基

分别配制Cl-free HBSS缓冲液、裂解液、125 mmol·L-1葡萄糖酸钠、4.8 mmol·L-1葡萄糖酸钾、1.3 mmol·L-1葡萄糖酸钙、1.2 mmol·L-1KH2PO4、1.2 mmol·L-1MgSO4、5.6 mmol·L-1葡萄糖、25 mmol·L-1HEPES(pH值7.4)、100 mmol·L-1NaOH。

培养基组成：DMEM培养基+10%胎牛血清+500 μg·mL-1G418+1%P/S。

1.3.2 细胞培养及接种

培养稳定表达hURAT1的HEK-293T细胞株，待细胞长到80%满时，弃掉培养基，加PBS缓冲液清洗细胞1次；之后加入胰酶-EDTA进行消化，待细胞脱壁时加入培养基，吹打使细胞脱落，离心收集细胞，加入培养基吹打成细胞悬液。

调整细胞密度为7×105个·mL-1，按每孔100 μL接种到96孔板中，培养12～24 h。

1.3.3 化合物溶液的配制

用DMSO将化合物配制成20 mmol·L-1的母液，再用DMSO稀释成1 mmol·L-1的溶液加入96孔板中。在96孔板上，另分别设置质控化合物，作为100×化合物板；在另一块96孔板上用Cl-free HBSS缓冲液进行对应孔的50倍稀释，作为2×化合物板；之后在一块新的96孔板上每孔加入30 μL含0.1 μCi·mL-114C-尿酸的缓冲液和30 μL的2×化合物，作为1×化合物板，待用。

1.3.414C-尿酸在稳定表达hURAT1细胞中的吸收

待96孔板中细胞培养贴壁后即可进行吸收实验。每孔用200 μL预热的缓冲液洗涤细胞1次，吸干各孔；之后立即加入50 μL含有对应化合物和0.1 μCi·mL-114C-尿酸溶液。将96孔板在37 ℃培养箱中孵育5 min,每孔立即加入150 μL冰冷的缓冲液以终止吸收。用缓冲液清洗每孔3次，清洗过程中，尽量避免细胞脱落。每孔加入50 μL裂解液，置于振荡器上以900 r·min-1的速度振荡5 min；每孔再加入150 μL闪烁液Microsint40，以900 r·min-1的速度振荡5 min。最后，微孔板送至MicroBeta2微孔板计数器测定放射活性。分析数据，用GraphPad Prism 5 软件计算各化合物的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 化合物的表征

化合物TF-001：m.p.153.2～157.8 ℃;MS,m/z：359.1[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.81～8.82(dd,J=3.0 Hz、5.0 Hz,1H),8.54(s,1H),8.18～8.20(d,J=8.5 Hz,1H),7.89～7.91(t,J=2.0 Hz,1H),7.35～7.34 (d,J=4.5 Hz,1H),7.19(br,1H),3.67～3.69(t,J=4.5 Hz、5.0 Hz,2H),3.43～3.46(dd,J=5.5 Hz、10.5 Hz,2H),1.75(s,6H)。

化合物TF-002：MS,m/z：373.2[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.82～8.83(d,J=5.5 Hz,1H),8.54(s,1H),8.19～8.21(d,J=9.0 Hz,1H),7.90～7.92(dd,J=2.0 Hz、8.5 Hz,1H),7.31～7.32(d,J=4.0 Hz,1H),7.26(s,1H)，3.58～3.60(t,J=5.5 Hz,2H),3.41～3.44(dd,J=6.0 Hz、12.0 Hz,2H),1.75～1.63(m,8H)。

化合物TF-003：1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.76～8.77(d,J=5.0 Hz,1H),8.61(s,1H),8.12～8.14(d,J=8.5 Hz,1H),7.84～7.85(t,J=2.0 Hz、7.0 Hz,1H),7.65～7.66(d,J=5.0 Hz,2H),3.72～3.74(t,J=5.0 Hz,4H),2.90～2.92(t,J=5.0 Hz,4H),1.67(s,6H)。

化合物TF-004：m.p.124.5～126.7 ℃；MS,m/z:351.1[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.39～8.40(d,J=5.5 Hz,1H),8.32(s,1H),7.44～7.45(dd,J=8.5 Hz,2H),7.30～7.32(dd,J=8.5 Hz,2H),7.14～7.27(m,2H),3.67～3.69(t,J=5.0 Hz,2H),3.42～3.45(dd,J=5.5 Hz、10.5 Hz,2H),1.61(s,6H)。

化合物TF-005：m.p.115.5～119.3 ℃；MS,m/z:365.0[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.40～8.41(d,J=5.5 Hz,1H),8.33(s,1H),7.44～7.45(dd,J=8.0 Hz,2H),7.31～7.33(dd,J=8.5 Hz,2H),7.10～7.27(m,2H),3.59～3.61(t,J=5.5 Hz,2H),3.40～3.43(dd,J=6.0 Hz、12.0 Hz,2H),1.60～1.69(m,6H)。

2.2 抑制活性结果(表1)

表1 抑制活性结果Tab.1 Inhibitory activity results

由表1可知，化合物TF-003的体外抑制活性优于对照药苯溴马隆。

3 结论

以2-甲基-2-(((6-三氟甲基)喹啉-4-基)硫代)丙酸乙酯(Ⅰ)和2-((3-(4-氯苯基)哌啶-4-基)硫代)-2-甲基丙酸乙酯(Ⅱ)与醇胺反应合成了5个新型稠杂环类化合物尿酸转运蛋白1(URAT1)抑制剂TF-001、TF-002、TF-003、TF-004、TF-005，其中化合物TF-003的体外抑制活性优于对照药苯溴马隆。