精液中冷冻保护剂加入比例对冷冻复苏后精子活动力的影响研究

李洪成

精子冷冻是生殖辅助技术中的一种,也是精子库的重要工作内容。在精子冷冻复苏后,精子成活率直接关系冷冻精子用于辅助生殖的效果［1］。有研究表 明［2］,精子冷冻后的活动力与诸多因素有关,主要包括精子质量、冷冻方法、冷冻保护剂的使用,其中冷冻保护剂使用情况在精子冷冻中发挥重要作用。目前常用的精子冷冻保护剂为蛋黄甘油复合型冷冻保护剂,在使用该过程中冷冻保护剂与精液的配比对精子冷冻保护效果有一定的影响［3］。为了探讨冷冻保护剂与精液配比对精子冷冻复苏后的活动力影响,本文选择1∶1、1∶3 配比冷冻的精子进行观察,分析复苏后前向运动精子百分比及精子活力情况,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本收集 选择2019 年3 月～2020 年6 月辽宁省妇幼保健院人类精子库精子捐献志愿者20 例,取得志愿者知情同意后进行实验,均禁欲7 d 后,手淫法留取精液4 ml 置于无菌取精杯中,在37℃水浴箱中液化处理。根据《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册(第5 版)》的相关要求［4］,对精液进行处理。所有留取精液液化时间均≤1 h,精子浓度≥50× 106/ml,精子活力≥50%。

1.2 方法

1.2.1 冷冻保护剂配置 采用蛋黄甘油复合型冷冻剂作为冷冻保护剂,制备过程如下：向37.4 ml 葡萄糖溶液(5%)中加入58.6 ml 的枸橼酸钠溶液(2.9%),在向混合溶液中加入56 ml 甘油,充分混匀后,采用微孔过滤器过滤,孔径选择0.45 μm。过滤后的溶液中加入 48 ml 的新鲜蛋黄,调节pH 值至6.8～7.2。然后加入 0.5 ml 庆大霉素(8 IU)进行细菌培养试验,将完成配置的冷冻保护剂在超净工作台上进行分装,每份10 ml,置于-80℃冻存,冷冻保护剂需3 个月内使用。

1.2.2 实验分组 取20 例志愿者精液,按照1∶3 分为甲组(1 ml)、乙组(3 ml)。取制备的蛋黄甘油复合型冷冻保护剂,按照1∶1、1∶3 的保护剂/精浆配比,分别向甲组、乙组中各加入1 ml 冷冻保护剂,完成实验分组。

1.2.3 冷冻与复苏方法 完成两组样本制备后转入冻存管中,置于4℃冰箱平衡10 min,然后经10 min 的液氮薰蒸,最后在液氮中冻存。待48 h 后,取出冻存精液,放在37℃的恒温水浴箱中进行精子冷冻后复苏。

1.2.4 精子活动力检查 精子活动力分别以精子前向运动百分比、活力检测并评价,按照《手册》标准和 要求,采用北京伟力彩色计算机辅助精液分析系统进行复苏后精液的处理分析,测定冷冻前及复苏后前向运动与精子活力。前向运动(PR)是精子主动呈现的直线或大圆周运动,非前向运动(NP)表示所有他非前向的精子运动,比如小圆周泳动及尾部摆动等。精子活力即精子总的活动率,以NP+PR 表示。

1.3 观察指标 对比两组冷冻前、冷冻复苏后前向运动精子百分比及精子活力。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数 ± 标准差()表示,采用t 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组冷冻前、冷冻复苏后前向运动精子百分比对比 冷冻前,两组前向运动精子百分比对比差异无统计学意义(P＞0.05)；冷冻复苏后,两组前向运动精子百分比均较冷冻前明显下降,但乙组高于甲组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 两组冷冻前、冷冻复苏后前向运动精子百分比对比(,%)

表1 两组冷冻前、冷冻复苏后前向运动精子百分比对比(,%)

注：与本组冷冻前对比,aP＜0.05；与甲组冷冻复苏后对比,bP＜0.05

2.2 两组冷冻前、冷冻复苏后精子活力对比 冷冻前,两组精子活力对比差异无统计学意义(P＞0.05)；冷冻复苏后,两组精子活力均较本组冷冻前明显下降,但乙组高于甲组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 两组冷冻前、冷冻复苏后精子活力对比(,%)

表2 两组冷冻前、冷冻复苏后精子活力对比(,%)

注：与本组冷冻前对比,aP＜0.05；与甲组冷冻复苏后对比,bP＜0.05

3 讨论

精子库冷冻精子是用于人类辅助生殖的重要技术,精子冷冻后复苏成活率直接关系着辅助生殖的效果［5］。在冷冻处理过程中,细胞外液会形成冰晶,使细胞外水分逐渐减少,增加了细胞外液的浓度,形成渗透压差,从而使细胞内水分流向细胞外,细胞脱水皱缩,从而形成冻存效果［6］。但精子冷冻过程还会产生活性氧,对精子细胞膜产生一定的破坏作用,使细胞内也产生冰晶,导致细胞内外渗透压差不明显,影响冻存效果。而细胞内冰晶的产生,还会影响精子的运动能力,且对精子的脱氧核糖核酸、线粒体功能等也会带来损伤,致使精子活动力降低,甚至导致精子死亡［7］。同时,正常的精浆中含有抗氧化物质,能够清除活性氧。冻存时,细胞表面的超氧化物自由基、羟基会明显增多,对精子保存不利。精子质膜脂质的过氧化在冻存时加剧,导致复苏后精子功能受损,精子活动力下降［8］。研究表明［9］,在精子冻融过程中,精子的头部浆膜会发生破损、肿胀情况,增加精子膜结构的不完整率,顶体膜及内容物脱落、丢失,精子活性降低。通过提升精子的能量代谢,有助于使精子复苏率和精子活力提升,保证精子细胞膜的完整性和通透性,防止冻存带来的损伤。

基于此,很多学者一直在寻找冷冻保护的有效措施,目前除了选择恰当的冷冻方法,冷冻过程使用冷冻保护剂显得尤为重要。冷冻保护剂的使用,使冷冻保护剂能够通过融入精液中形成保护环境,减少冷冻造成的氧化损伤。并且,保护剂的加入能够降低细胞外液的电解质浓度,还有助于减轻对精子细胞产生的不利影响。所以,需要在精液冻存时加入冷冻保护剂,形成对精子细胞的保护。但实际上冷冻保护剂的加入比例会影响冻存保护效果,不同的保护剂/精浆配比产生的保护效果不同,并不是冷冻保护剂使用的越多越好［10］。精浆本身对精子的保护效果就很好,如果过多的加入冷冻保护剂,可能会破坏精浆的保护作用,起到反效果。因此,恰当的保护剂/精浆配比在精液冻存中具有重要价值,对提升冷冻复苏后精子活动力具有一定的作用。目前常采用的保护剂/精浆配比为1∶1,但经过实际工作经验总结发现,不同配比会影响精子复苏后的活动力,并且冷冻保护剂的制备和消耗会增加精子冻存成本。基于此,结合经验认为1∶3 的保护剂/ 精浆配比也许不仅能够达到理想的冻存保护作用,还能够降低冻存保护剂使用量,节约成本。

为了进一步验证1∶1、1∶3 保护剂/精浆配比冷冻保护剂使用对冷冻复苏后精子活动力的影响,本次研究通过取志愿者精液进行处理,按照保护剂/精浆配比1∶1 和1∶3 分为甲组和乙组,并进行冻存-复苏实验,利用实验前后两组的精子活动力变化分析精液中加入冷冻保护剂比例带来的影响。研究结果显示,冷冻复苏后,两组前向运动精子百分比均较冷冻前明显下降,但乙组前向运动精子百分比(42.36±4.63)%高于甲组的(33.48±4.56)%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。冷冻复苏后,两组精子活力均较本组冷冻前明显下降,但乙组精子活力(55.64±3.12)%高于甲组的(52.14±3.08)%,差异具有统计学意义(P＜0.05)。证实冷冻保存虽然能够减缓精子失效速度,但仍然会降低冷冻复苏后精子活动力。而乙组冷冻复苏后的前向运动精子百分比、精子活力均明显高于甲组,则说明1∶3 的精液中冷冻保护剂加入比例,能够更好的发挥保护作用,减缓冰冻带来的损伤,改善冻存复苏后精子活动力。

综上所述,不同精液中冷冻保护剂加入比例可对冷冻复苏后精子活动力产生影响,相比于保护剂/精浆配比1∶1,配比1∶3 复苏后精子活动力保护的更好,下降幅度更小,减少了冷冻带来的精子活动力损伤。