微小RNA表达在1型糖尿病视网膜病变中的研究进展

陶丹 刘莉 杨家义

糖尿病在全球的患病率很高,根据国际糖尿病联盟2013 年的最新调查结果证明,中国拥有9800 万 糖尿病患者,是全球20～79 岁DM 患者数量最多的国家［1］。我国糖尿病流行病特点以2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM) 为主,1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)约占5%,多于儿童或青少年时期起病,在儿童及青少年患者中,T1DM 所占比例约为80%～90%［2］。根据在2009 年国际糖尿病联合会对外公布的总数据,全球T1DM 患儿约有3000 万,其中我国有100 万患儿［3］。且根据流行病学的调查报告研究得出T1DM 的发病率正在以每年近3%的速率急速增长,且患儿逐渐面向低龄化的趋势［4］。T1DM 已成为危害青少年身体健康的公共卫生问题。美国的一项流行病学调查研究结果显示,病程在3～4 年的时间的患者,其中T1DM 的糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)发生率为19%,T2DM 的DR 患病率达24%；在已有20 年病程的T1DM 的患者中,患DR 的几率几乎为100%,在同样有20 年病程的T2DM 患者中,患DR 的几率达60%；而在病程＞20 年的患者中,50%左右的T1DM 患者会发生增生性糖尿病视网膜病变(PDR)。目前DR 已经成为世界范围内劳动年龄人口失明的最重要原因［5］。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为18～25 个核苷酸、内生性单链非编码RNA分子,对DR 形成进行期间的细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期与血管形成等过程施加了一定影响。DR 发生的发病机制不清,了解miRNA 在DR 发生发展中的作用机制,将有助于阐明DR 的发病机制,对预防和控制DR 的发生发展提供新的思路和方案,本文就miRNA与1 型糖尿病视网膜病变发病机制的相关研究进展综述如下。

1 1 型糖尿病视网膜病变的流行病学调查

2007～2008 年,中华医学会糖尿病学分会组织全国14 个省市进行糖尿病流行病学调查［6］,调查结果显示我国约有9240 万的成人糖尿病患者,其中9.7%的糖尿病患者的年龄＞20 岁［7］。2011 年IDF 统计,全球年龄＜15 岁的儿童中,约有49 万的T1DM 患者,每年新增7.7 万人,年增加率约3.0%［8］。Roy 等［9］研究发现美国白种人及黑种人18～30 岁的T1DM 患者中,DR的发病率分别为82.3%和74.9%。Malone 等［10］研究发现5 年病程1613 例T1DM 的患者,67.1%患有DR。Klein 研究［11］报道T1DM 患者4 年病程内DR 的发病率为49%,研究同时发现T1DM 患者病程1 年内的DR发病率为20%,并因此建议T1DM 患者在确诊1 年内进行扩瞳后眼底检查。

对于T1DM 患者DR 的筛查时机没有统一的标准。美国糖尿病医疗标准推荐T1DM 成年人应在糖尿病发病后5 年内,由眼科医师或验光师进行初次的散瞳眼部综合检查［12］。英国指南建议T1DM 患者应从12 岁开始DR 的眼底筛查；澳大利亚指南认为青春期前诊断的T1DM 患者应在青春期后开始DR 筛查；加拿大指南推荐在青春期之后诊断的糖尿病患者应在诊断3～5 年后开始DR 筛查。我国建议青春期前或青春期诊断的T1DM 患者在青春期(12 岁)后开始检查眼底,青春期后诊断T1DM 的患者建议在病程5 年内,必须进行第1 次DR 筛查,同时建议T1DM 患者开始DR 筛查后至少每年复查1 次［13］。

2 miRNA 概述

1993 年Lee 等［14］首次在线虫发育过程中发现了被命名为lin-4 第1 个miRNA。此后,研究人员在多个生物物种中,都发现了miRNA 的存在。至今已被成功克隆排序的人类基因量在800 个以上,预估miRNA 基因数量在1000 个以上,同时所调控的人类基因占比已达30%以上［15］。miRBase 数据库(由英国Sanger 研究所构建)［16］在记录miRNA 序列诸数据库中,其最具权威性,截止当前,此数据库所收录的成熟miRNA 序列信息类型已达25141 种,涉及到193 个物种。miRNA占动物基因总数的1%～5%［17］,在人类基因组中,估计编码＞1000 个mRNA,其中miRNA 可能调控＞1/3 的蛋白编码基因［18］。

miRNA 属于一类单链非编码RNA 小分子,其长度为20～24 个核苷酸左右,由内源性发夹型转录而 成［19］。其对任何蛋白质均不具备编码功能,是一类新型的基因表达调控因子。多个mRNA 的表达可被单个miRNA 调节；而且60%以上的mRNA 含若干条miRNA 的结合位点,能够同时与若干miRNA 发生交互反应。miRNA 所具备的特征有：表达的时序性、保守性以及高度特异性。从生物学角度看,MiRNA 的合成过程非常复杂［20］,首先,在细胞核内,在RNA 聚合酶Ⅱ介导下,经转录生成“发夹”pri-miRNA,此物质具备特征性茎环结构,之后,被Drosha/DGCR8 此蛋白复合体核心区域基因识别与切割,产生pre-miRNA。核-胞质穿梭蛋白可识别此产物,同时促进其向细胞质迁移,在核糖核酸Ⅲ Dicer 作用下,待将较短的(21-23)nt双链RNA 序列留下,接着结合Ago 蛋白,转变为RNA诱导沉默复合体(RISC)。此复合体的成熟态能够互补配对结合靶mRNA 的3'非编码区(3'UTR),对靶mRNA表达进行阻抑,进而抑制或降解靶mRNA 翻译。

3 miRNA 与糖尿病视网膜病变

近期,miRNA 被证明是糖尿病重要的调节者和参与者。通过研究,Latreille 等［21］提出,对于胰岛B 细胞生成胰岛素的功能,miRNA-7a 发挥着负向调控效应,将小鼠B 细胞所含miRNA-7a 作敲除处理,可以提升胰岛素分泌量。就miRNA-187 表达水平而言,相较于正常群体,T2DM 患者较高,miRNA-187 表达上调,可以对HIPK3 施以调控,导致胰岛素的释放受抑,表明,通过下调miRNA-187 的表达,能够治疗T2DM［22］。Setyowati 等［23］对GK 大鼠开展了相关研究,结果表明,相较于健康组大鼠,糖尿病组的实验动物在29 类miRNA 的表达上,表现出了明显的差别,这些miRNA中,脂肪组织内miRNA-222 以及miRNA-27a 显示表达增强,肝组织内的miRNA-195 以及miRNA-103 也显示为表达上调。在肌肉细胞中miRNA-10b 的表达下调［24］,在外周血单核细胞中miRNA-146a 的表达下调［25］。同时,Kong 等［26］通过检测DM 患者血浆中 的miRNA 发 现miRNA-9、miRNA-29a、miRNA-30d、miRNA-34a、miRNA-124a、miRNA-146 及miRNA-3757 的表达发生了改变。

通过微阵列技术,Xu 等［27］首次从成年小鼠中分离获得80 个不同的miRNA,其中在视网膜呈特异性表达的miRNA 有23 个。近年随着下一代测序技术(next generation sequencing,NGS)的发展和运用,大大提高了miRNA 检出的敏感性,在视网膜中发现超过约250 个miRNA 的表达［28］。

视网膜新生血管的形成以及血管通透性的增强是DR 发生的重要机制。血管内皮生长因子(VEGF)在DR 病理反应中发挥着关键性的影响,若此因子水平增强,能够促进血管生成,同时可提升血管通透性。VEGF 与细胞表面相应受体结合后,激活细胞内多个信号转导通路,导致内皮细胞增生、迁移、形成新生血管腔。Kovacs 等［29］对比检测了正常和糖尿病大鼠视网膜组织的miRNA,结果发现86 种miRNA 在糖尿病大鼠视网膜中有显著差异性表达,这与视网膜疾病的发生密切相关。同时证实由VEGF 诱导的6 种miRNA(miR-17-5p、miR-18a、miR-20a、miR-21、miR-31 和miR-155)在DR 大鼠的视网膜血管内皮细胞(retinal endothelial cells,REC)中表达增高,提示miRNA 可能通过调控VEGF 表达增高而参与了DR 发生的病理过程。McArthur 等［30］研究发现miR-200b在高糖处理的内皮细胞及DM 大鼠视网膜中表达下降,而其直接靶基因VEGF mRNA 及蛋白表达均增加。Murray 等［31］对大鼠视网膜Müller 细胞采取了诱导处理,所用诱导剂为miRNA-200b 增强剂,结果发现,同存在一定联系关的4-羟基壬烯醛(4-HNE)此氧化应激源显示为程度不等的增加,可见,在视网膜神经细胞氧化应激(OS)机制中,miRNA-200b 发挥着抗细胞凋亡效能,同时发现miRNA-200b 还能作用下游的抗氧化1(oxidation resistance 1,Oxr1)基因,从而对DM 起到保护作用。此外,内皮细胞内miRNA-1 表达减弱,导致其靶基因ET-1 和纤连蛋白量升高,导致眼底视网膜血管收缩与纤维沉淀的发生［32］。

核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)在REC 增殖以及表达诸多类型的炎症相关基因方面,发挥着调控枢纽作用,同DR 的形成、进行存在显著联系。miRNA 与视网膜炎性反应有关。miR-146a 参与NF-κB 炎症通路的调节［33］。相关实验结果表明,对DM 小鼠的REC 具备诱导作用的miR-146、miR-21、miR-132 以及miR-155 存在不断升高表现,导致RECNF-κB 途径的活化,从而促进其下游基因MCF-1 以及黏附因子-1 的转录提升,对视网膜炎性反应施以进一步激发。Ye 等［34］研究发现miR-146a 在高糖培养的HREC 中表达下降,而过表达miR-146a 能够使TLR4/NF-κB 以及TNF-α 下调,表明在DR 炎症机制中miR-146a 参与了NF-κB 活化的负性调节。Feng等［35］研究发现miR-146a 在T1DM 大鼠模型中REC的表达减弱,纤维黏连蛋白(FN)则表达上调,促使视网膜微血管内皮细胞迁移、损伤,引起相关DR 的病理改变。

神经胶质细胞反应性增生和神经元凋亡是DR 主要的神经损伤改变。神经胶质细胞的功能障碍［36］、神经元细胞的凋亡先于视网膜周细胞和内皮细胞的凋亡出现［37］。在DR 中,若p53 活化,会增强miR-34 家族(miRNA-34a/b/c)表达,表明,miR-34 家族同由p53诱导所致的REC 凋亡存在一定联系。He 等［38］敲除老鼠miRNA-34 基因发现p53 诱导的细胞凋亡被阻滞,表明在p53 调控网络中,miRNA-34 扮演着重要的角色。Kovacs 等［29］研究也发现miRNA-34c 在糖尿病大鼠视网膜组织及视网膜色素上皮细胞中表达有显著上调,同时发现在DR 中有p53 的活化,因此认为由miRNA-34 家族成员介导的p53 诱发的细胞凋亡和神经退变参与了DR 的发生发展。

综上所述,miRNA 是糖尿病重要的调节者和参与者,目前已有循环miRNA 用于T2DM 早期诊断的生物标志物。DR 中患者的外周血血清、视网膜细胞中也存在很多表达异常的miRNA,这些miRNA 在DR 的发生发展中起到了重要的作用,有的促进DR 的发生发展,有的抑制DR 发生发展。随着miRNA 在DR 发生发展中的分子机制研究逐渐深入,越来越多的miRNA及其对DR 的调控机制将被证实。但目前对其在DR作用机制中的分子机制研究尚无明确定论。进一步研究miRNA 在DR 的分子作用机制,miRNA 有可能成为早期预警、早期诊断及早期干预DR 的生物学指标,并成为DR 新的基因靶向治疗提供理论依据。