白头翁汤对结直肠癌小鼠肠道菌群、炎症因子及HER－2表达的影响

宋聚才，巩跃生，刘全林

（郑州市大肠肛门病医院，河南中医药大学附属郑州市大肠肛门病医院，河南省肛肠病医疗中心，河南 郑州 450004）

结直肠癌（CRC）是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一，也是导致死亡的主要癌症因素之一。近年来，随着我国人民生活水平的提高及饮食结构的改变，CRC的发病率明显升高［1－2］。手术是早期治疗CRC 最好的选择，也是唯一能根治CRC 的方法，但对于中、晚期CRC 的治疗，临床上只能采取放化疗或靶向治疗等方法缓解患者病情［3］。目前对于各个时期的结直肠癌，中医均有着积极的治疗作用，尤其对于长期接受放化疗的患者而言，中医药治疗可减轻放化疗的副作用，增强其疗效［4］。本研究通过观察白头翁汤对结直肠癌小鼠肿瘤生长情况、肠道菌群及血清炎症因子与人表皮生长因子受体2（HER－2）表达的影响，以期为白头翁汤对CRC的临床治疗提供一定理论与实验支持。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选用6～8周龄，体质量（20.0±2.0）g，SPF级人源化Balb/c 雌性小鼠［动物批准号：SYXK（粤）2021－0009］40 只为研究对象。常规饲养于清洁级实验室中，温度（22 ± 2）℃、湿度（50 ± 10）%、10 h/14 h 昼夜交替。

1.2 主要药品及试剂

顺铂（齐鲁制药厂，国药准字：H37021356）；MMP－9、VEGF、IL－10 及TNF－α 酶联免疫试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号：20200315）；白头翁汤组方：白头翁15 g，黄柏、秦皮各12 g，黄连6 g，将上述药材水煎、过滤、浓缩成含生药1.0 g/mL 浓度药液，高压灭菌后－4 ℃保存待用，所有中药药材均来源于郑州市大肠肛门病医院中药房。

1.3 主要仪器

离心机（美国贝克曼库尔特公司）；切片机（德国Leica公司）；显微镜（日本Olympus）；全自动酶标仪（上海闪谱生物科技有限公司）；全自动显微照相系统（日本Olympus）；电子天平（美国奥豪斯公司）。

1.4 造模、分组及给药方法

将处于对数生长期的小鼠结直肠癌细胞株（CT 26，四川大学华西医学院实验室保种）接种于小鼠左侧腋前皮下，细胞接种量为2 × 105个/0.2 mL。接种4 d后见肿瘤长出，即视为造模成功。依据随机数字法将小鼠分为对照组和研究组，每组各20 只。对照组小鼠给予顺铂0.1 mL 尾静脉注射治疗，每周1 次，共治疗6 周。研究组在对照组基础上给予白头翁汤灌胃，剂量为25 mg/（kg·d），每治疗6 d后休息1 d，共治疗6周。于第6周给药结束后采用断颈法处死小鼠。

1.5 观察指标

1.5.1 肿瘤生长情况

于治疗期间每周采用游标卡尺测量1 次肿瘤长短径情况，并做好记录。比较两组小鼠给药前后结直肠肿瘤生长情况，并绘制肿瘤体积生长曲线。

1.5.2 肠道菌群

于给药3、6周后分别抽取各组小鼠粪便（0.1 g）作为样本，并将其放置于9 mL 的无菌生理盐水中搅拌稀释（稀释至106倍），制成混悬液，取0.1 mL 混悬液在培养基上涂抹，37 ℃条件下培养24 h 左右。对细菌菌落形态进行观察，并计数。

1.5.3 血清炎症因子水平

分别于给药前及给药3、6 周后采集小鼠血液1 mL，以2 500 r/min的离心速度离心10 min后，收集血清，－80 ℃超低温冰箱保存。采用酶联免疫吸附法检测小鼠血清中基质金属蛋白酶－9（MMP－9）、血管内皮生长因子（VEGF）、白细胞介素－10（IL－10）、肿瘤坏死因子－α（TNF－α）表达水平，并严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.4 肿瘤组织中HER-2表达

采用免疫组织化学方法观测肿瘤组织标本中HER－2 的表达。将各组小鼠的病灶处组织进行石蜡包埋，将石蜡包埋组织切片（厚度4 μm），常规脱蜡，60 ℃下烤片过夜，置入50 μL 3%过氧化氢溶液中，常温下孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3 次，加入50 μL 的一抗，4 ℃下过夜后，加入二抗，20 ℃孵育10 min，DBA试剂盒显色，显微镜观察，显色后蒸馏水洗掉，终止显色，苏木素复染2 min，中性树胶封片。每张切片随机抽取4 个高倍镜视野（400×），以细胞呈棕黄色染色情况判断，超过10%的肿瘤细胞呈现微弱、不完整的细胞膜着色则为阳性表达，反之则为阴性表达。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件处理，本研究中计量资料以均数±标准差（）表示，采用独立样本t检验或方差分析和配对t检验。以P<0.05 代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组小鼠给药前后结直肠肿瘤生长情况比较

给药第4、5、6 周时，研究组结直肠肿瘤体积均明显小于对照组（P<0.05）。给药6周后，研究组小鼠结直肠肿瘤质量为（0.32±0.09）g，显著低于对照组的结直肠肿瘤质量（0.65 ± 0.12）g（t= 9.839，P< 0.001）。见表1和图1。

表1 两组小鼠给药后直肠肿瘤体积比较（±s，mm3）

表1 两组小鼠给药后直肠肿瘤体积比较（±s，mm3）

组别研究组对照组t值P值n 20 20给药4周后205.38±14.64 352.14±28.73 20.345<0.001给药5周后228.16±19.57 439.56±33.25 24.504<0.001给药6周后298.75±24.57 574.73±42.25 25.253<0.001

图1 两组小鼠直肠肿瘤生长曲线

2.2 两组小鼠肠道菌群情况比较

给药前，两组大鼠厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门及拟杆菌门菌落数比较，差异无统计学意义（P>0.05）。给药3、6 周后，研究组梭杆菌门、拟杆菌门菌落数较对照组降低，厚壁菌门、变形菌门菌落数较对照组上升（P<0.05）。见表2。

表2 两组小鼠给药前及给药3、6周后肠道菌群菌落数情况比较（±s，个）

表2 两组小鼠给药前及给药3、6周后肠道菌群菌落数情况比较（±s，个）

注：与对照组给药3周后比较，aP<0.05；与对照组给药6周后比较，bP<0.05；与同组给药前比较，cP<0.05。

拟杆菌门43.32±3.46 36.63±3.37ac 34.89±3.48bc 43.25±3.24 40.36±3.27c 37.48±3.15c组别研究组n 20对照组20时间给药前给药3周后给药6周后给药前给药3周后给药6周后厚壁菌门29.18±3.42 33.24±3.37ac 36.35±3.48bc 28.57±3.38 30.46±3.46c 33.18±3.37c变形菌门10.21±1.34 13.75±1.46ac 15.08±1.43bc 10.03±1.37 11.85±1.46c 13.23±1.54c梭杆菌门13.79±2.23 7.04±1.13ac 3.45±0.89bc 13.86±2.13 9.73±1.17c 7.82±1.05c

2.3 两组小鼠给药前及给药3、6 周后血清炎症因子水平变化情况比较

与给药前比较，两组小鼠给药3 周、6 周后血清MMP－9、VEGF、IL－10 及TNF－α 浓度均明显降低（P<0.05）；给药3周、6周后研究组小鼠血清MMP－9、VEGF、IL－10及TNF－α浓度均低于对照组（P<0.05）。见表3。

表3 两组小鼠给药前及给药3、6周后血清炎症因子水平比较（±s）

表3 两组小鼠给药前及给药3、6周后血清炎症因子水平比较（±s）

注：与对照组给药3周后比较，aP<0.05；与对照组给药6周后比较，bP<0.05；与同组给药前比较，cP<0.05。

TNF－α（ng/mL）15.02±3.31 9.67±2.34ac 5.11±1.98bc 14.87±3.24 12.28±2.67c 7.98±2.13c组别研究组n 20对照组20时间给药前给药3周后给药6周后给药前给药3周后给药6周后MMP－9（mg/L）389.58±33.62 330.21±25.17ac 308.37±20.42bc 387.24±32.47 350.74±26.48c 332.23±24.13c VEGF（pg/mL）10.92±2.24 6.78±1.55ac 5.07±1.13bc 10.78±2.19 8.52±2.07c 6.38±1.24c IL－10（mg/L）180.57±33.53 132.34±24.55ac 108.33±18.19bc 177.64±31.27 152.85±26.17c 117.93±22.42c

2.4 两组小鼠肿瘤组织中HER－2表达情况比较

给药6周后，各组小鼠肿瘤组织中HER－2阳性产物定位于细胞膜中。研究组小鼠肿瘤组织中HER－2阳性表达率为20%（4/20），明显低于对照组的HER－2阳性表达率60%（12/20），差异具有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图2 HER－2在结直肠癌组织细胞膜中的阳性表达（DBA染色，×400）

3 讨论

CRC 是临床常见的消化道恶性肿瘤，其发病原因目前尚未完全清楚，通常认为良性腺瘤（乳头状腺瘤、家族性多发性结肠息肉）恶性变、高脂肪膳食、低渣饮食等是CRC 的主要诱发因素［5－6］。临床研究表明，CRC 的发病机制与自身免疫调节密切相关，有大量炎症因子介导的炎症反应通过调节机体各种免疫细胞的增殖、分化及免疫功能激活等过程参与到CRC 的生理及病理反应过程中［7－8］。近年来，对于中、晚期结直肠癌的临床治疗虽然取得了较大的进步，但常用针对性及敏感性高的化疗药物，如顺铂类、氟尿嘧啶及伊立替康等，不良反应明显，且近10年来，临床上尚未有新的化疗药物上市［9］。中医学将本病归为“积聚”“肠积”“癥瘕”范畴，认为其发病机制为邪毒入侵、饮食失节、情志不调及旧疾等因素影响，导致脾胃受损，气血不畅，湿浊内生，日久浊毒瘀积而形成肿瘤，因此中医治疗常以祛瘀散结解毒为主［10］。

白头翁汤最早记载于《伤寒论》，由白头翁、黄柏、秦皮、黄连组成，其中白头翁具有凉血止痢、清热解毒的功效；黄柏具有泻火补水、清热燥湿的功效；秦皮可起到收涩止痢、清热燥湿的作用；黄连具有泻火解毒、清热燥湿的功效。以上诸药共用可凉肝益肾、清热解毒［11－12］。本研究将其应用于CRC 小鼠的治疗，结果发现，给药6周后，研究组小鼠CRC肿瘤体积及质量均明显小于对照组，表明白头翁汤对小鼠CRC 肿瘤的生长起到了明显的抑制作用。

CRC 临床表现为身热、脓血便、腹泻、肛门灼热及小便短黄等症状，这是湿热内蕴的表现，这些症状均与炎症反应有着密切关系［13］。IL－10作为一种免疫抑制因子，可通过多种途径抑制免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用，从而有利于肿瘤的增殖和进展［14］。TNF－α是最常见的炎症因子，在CRC 炎症反应中起到重要作用［15］。现代药理学研究认为［16］，白头翁的有效成分具有较强的抗炎、抗菌作用。黄柏的有效成分对大肠杆菌、葡萄球菌等菌类产生明显的抑制作用，并具有较强的抗炎效果。秦皮中的有效成分具有明显的抗炎镇痛作用。MMP－9 是MMP 家族成员之一，可影响机体免疫，促进肿瘤血管生成，从而加速肿瘤的增殖和生长过程，MMP－9 在恶性癌组织及血清中均呈现出较高水平的表达，与肿瘤进展程度密切相关［17］。VEGF 为临床公认的促血管生成因子，可通过调节肿瘤细胞旁途径，促进内皮细胞迁移及肿瘤新生血管生成，是影响肿瘤发生和发展的重要炎症因子［18］。HER－2是HER 家族成员之一，主要存在于细胞膜上，当HER 被激活后可加速肿瘤细胞侵袭和转移，此外，HER 还可通过抑制体内免疫系统的修改能力，加速VEGF 因子的表达，最终起到促进肿瘤的发生、发展及侵袭的作用［19］。HER－2 受体基因可通过细胞生长因子信号传导通路，对正常细胞的生长与分裂起作用［20］。本研究结果显示，给药3、6 周后研究组小鼠血清MMP－9、VEGF、IL－10 及TNF－α 浓度均低于对照组，提示白头翁汤可有效降低CRC 小鼠血清MMP－9、VEGF、IL－10 和TNF－α 的表达水平。给药6 周后，研究组HER－2 阳性表达低于对照组，这也可能是研究组给药后肿瘤体积及肿瘤质量均更低的重要原因。

综上所述，白头翁汤可有效改善结直肠癌小鼠紊乱的肠道菌群，有效降低结直肠癌小鼠血清炎症因子及HER 的表达，抑制肿瘤增大和生长，临床治疗效果满意，但其抗肿瘤机制仍需进一步深入研究。