紫草素对慢性皮肤溃疡大鼠间隙连接蛋白家族的蛋白表达及基因表达水平的影响

杜伟鹏，张现峰，王晓歌，马立人

（平顶山中医医院，河南 平顶山 467000）

皮肤溃疡是一种由多种原因引起的难治性皮肤病，从肉体和精神上对患者造成双重的痛苦，其主要特征是病程迁延、长期不能愈合，一般超过2周不愈合即可认定为慢性皮肤溃疡［1］。同时，慢性皮肤溃疡伴随的慢性炎症具有致癌的风险［2］。目前我国对于慢性溃疡大样本人群调查尚未广泛展开，但该病的危害已经无法忽视。随着科学技术的发展，对该病的治疗已经取得长足的进步，目前西医主要以外用药物、高压氧疗、生长因子、皮肤移植和负压伤口治疗等手段为主［3］，虽然治疗手段众多，但疗程长、代价大，效果也不尽如人意。中医学对于慢性皮肤溃疡的治疗经验丰富，多种药物在该病的治疗中均显现出价值，其中以紫草的疗效最为突出。紫草素是从紫草中提取的一种萘醌类化合物，对于促进皮肤愈合具有良好的效果［4］，但其作用机制尚未明确。本研究就紫草素对慢性皮肤溃疡大鼠间隙连接蛋白（Cx）的影响展开研究，以期为紫草素治疗慢性皮肤溃疡提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康SD 大鼠42 只，体质量300～320 g，8～12 周龄，雌性各半，购于上海西普尔－必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2018－0006。适应性饲养1 周后用于实验，饲养条件：室温22～25 ℃，相对湿度50%～70%，光暗同步各12 h，自由摄食饮水。此次研究获得江西中洪博元生物技术有限公司实验动物伦理委员会批准，批号：2019120601，所有实验动物的饲养和处理均符合实验动物管理和使用规定。

1.2 主要试剂和仪器

紫草素（HPLC ≥98%，上海脉铂医药科技有限公司，货号：MED80061－1 g）；医用凡士林纱布（新乡市华西卫材有限公司，批号：1936031）；重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶（贝复新，珠海亿胜生物制药有限公司，批号：G41B10158）；免疫组化试剂盒（上海博湖生物科技有限公司，货号：BH－S63629）；逆转录试剂盒（上海博湖生物科技有限公司，货号：BH－S63784）；Cx26、Cx32、Cx43 二抗（美国Biovision，货号：3331－100、3330－120、3330－115）；甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GADPH，北京百奥莱博科技有限公司，货号：ARB11900）。

实时荧光定量PCR 仪（美国伯乐Bio－Rad，型号：CFX96）；全自动组织包埋装置（沈阳恒松科技有限公司，型号：HS－B7126－B）；石蜡切片机（沈阳恒松科技有限公司，型号：HS－S7220－B）；荧光多功能显微镜（日本奥林巴斯，型号：CX43）；全波长酶标仪（山东莱恩德智能科技有限公司，型号：LD－96A）；垂直电泳转印系统（美国伯乐Bio－Rad，型号：1658033）；微量核酸蛋白分析仪（北京创誉科技有限公司，型号：Aurora－900）。

1.3 模型构建和分组

所有大鼠在造模前4 d 注射青霉素钾溶液（400 U/只）防止感染，每天1 次。4 d 后随机选择30 只大鼠采用戊巴比妥钠麻醉，标记4 cm×4 cm 面积剃除背部毛发，8%硫化钠脱毛，无菌条件下制备2 cm ×2 cm 创面面积，按印迹剪去全层皮肤，深至筋膜，避开较大血管，造成缺损性创面，肌注氢化可的松60 mg/kg，50%冰醋酸溶液涂抹创面，医用纱布覆盖、包扎，1 周后形成慢性皮肤溃疡模型。造模成功标准：大头针刺创面5 mm，无渗血且溃疡表面有肉芽组织生长［5］。选择24 只造模成功大鼠，依据随机数字表随机分为模型组和紫草素组，每组12 只。12 只未造模大鼠作为假手术组，仅在背部相应部位分离皮瓣，原位缝合。

1.4 给药方法

给药时间为造模1 周后，给药前均采用生理盐水棉球清洗创面，擦拭分泌物。清洁后进行药物干预，并用纱布覆盖。模型组给予1 890 U/cm2重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶涂抹创面，紫草素组给予4 mg/mL紫草混悬液（大豆油稀释）涂抹，具体剂量参照“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”换算。假手术组和模型组给予等量生理盐水外敷。每日换药1次，连续给药14 d。

1.5 观察指标和方法

1.5.1 一般情况

每日观察大鼠形态、体征、行为等一般情况。

1.5.2 创面愈合情况

分别在干预7、12 d 后观察创面愈合情况，计算创面愈合率。玻璃纸覆盖创面，描绘溃疡边缘，沿边缘剪下后称重，按面积比值计算溃疡面积，由同一名医师测量，测量3次取平均值。

创面愈合（%）=（干预前创面面积- 干预后创面面积）／干预前创面面积×100%

1.5.3 溃疡创面病理组织学变化

干预7、12 d 后，无菌条件下采用手术器械分离溃疡创面肉芽组织低温冻存待检，取部分组织进行石蜡切片、HE染色，显微镜下观察病理变化。

1.5.4 Western Blot 法检测溃疡组织Cx26、Cx32、Cx43蛋白表达

干预12 d 后，取待检溃疡肉芽组织，冰上加入RIPA 裂解液，充分震荡、离心后吸取上清液；PBS 洗涤剪块匀浆，离心收集上清液，获得总蛋白溶液。加入细胞浆蛋白抽提试剂A 和B，再次离心后获得细胞浆蛋白，采用BCA 法测定蛋白浓度。经SDS－PAGE 电泳后在300 mA 恒流下转膜，30 min 后使用5%脱脂牛奶封闭，4 ℃孵育稀释后加入一抗，过夜后加入二抗，加入发光液之后进行曝光、显影、定影。采用Alpha 软件分析目标带光密度值。

1.5.5 RT－PCR 法检测溃疡组织Cx26、Cx32、Cx43 mRNA相对表达

干预14 d 后取溃疡肉芽待检组织，充分研磨后分离蛋白，提取RNA，检测RNA 浓度，逆转录后获得cDNA。选择20 μL 体系进行Real time－PCR 反应，cDNA 1.5 mmol/L。引物由武汉益普生物科技有限公司合成，反应条件：95 ℃变性15 s，60 ℃退火并结合到靶序列上，延伸1 min，扩增40 个循环。以GAPDH 作为内参，采用2－ΔΔCT法分析mRNA相对表达量。

1.6 统计学方法

采用SPSS 25.0 统计软件对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验，以P<0.05代表差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

干预期间无大鼠死亡，各组大鼠体质量、活动度未见明显变化。

2.2 各组大鼠创面愈合情况比较

与本组治疗前比较，模型组、紫草素组大鼠干预12 d 后创面愈合率均高于7 d 后（P<0.05）；与模型组同时间比较，紫草素组干预7、12 d 后创面愈合率差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组大鼠干预7、12 d后创面愈合率比较（±s，%）

表1 各组大鼠干预7、12 d后创面愈合率比较（±s，%）

注：与本组干预7 d后比较，aP<0.05。

组别假手术组模型组紫草素组干预12 d—91.77±4.95a 93.03±2.26a n 12 12 12干预7 d—34.24±11.59 40.79±10.08

2.3 各组大鼠溃疡创面病理学变化比较

假手术组大鼠皮肤组织在干预7、12 d后均有完整的皮肤结构，表皮、真皮、皮下组织，未见炎性细胞浸润；模型组大鼠在干预7 d 后伤口组织没有完整的结构，表皮缺失，伤口部位有大量炎性细胞浸润、聚集；与模型组比较，紫草素组大鼠在干预7 d后表皮层和真皮层的细胞数明显增多，皮层变厚，炎性细胞浸润减少。模型组大鼠干预12 d后伤口仍没有形成明显完整的皮肤结构，炎性细胞浸润减少；紫草素组大鼠干预12 d后已经有明显的表皮形成，小鼠伤口愈合速度明显优于模型组。见图1。

图1 各组大鼠溃疡创面肉芽组织病理变化图（HE，×200）

2.4 各组大鼠溃疡创面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表达情况比较

干预12 d 后，模型组、紫草素组Cx26、Cx30、Cx43蛋白均低于假手术组（P< 0.05）；紫草素组Cx26、Cx30、Cx43蛋白表达高于模型组（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠溃疡创面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠溃疡创面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表达比较（±s）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

组别假手术组模型组紫草素组Cx43 1.04±0.22 0.36±0.09a 0.65±0.18ab n 12 12 12 Cx26 1.05±0.21 0.24±0.08a 0.43±0.10ab Cx32 1.02±0.25 0.40±0.11a 0.74±0.23ab

2.5 各组大鼠大鼠溃疡创面Cx26、Cx30、Cx43 mRNA相对表达比较

干预12 d 后，模型组、紫草素组Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 低于假手术组（P< 0.05）；紫草素组Cx26、Cx30、Cx43 mRNA高于模型组（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠溃疡创面Cx26、Cx30、Cx43mRNA相对表达比较（±s）

表3 各组大鼠溃疡创面Cx26、Cx30、Cx43mRNA相对表达比较（±s）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

组别假手术组模型组紫草素组Cx43 0.98±0.17 0.43±0.11a 0.59±0.11ab n 12 12 12 Cx26 0.95±0.21 0.41±0.12a 0.65±0.17ab Cx30 1.02±0.09 0.48±0.10a 0.69±0.18ab

3 讨论

中医学认为，慢性皮肤溃疡属“顽疮”“溃疡”“褥疮”等范畴，相关记载最早可见于《黄帝内经》。该病的病因无外乎内伤、外感。内伤或因饮食失节、劳力过度，外感多由各种原因造成的外伤和六淫之风、寒、暑、湿、燥、火［6－7］。中医学对慢性皮肤溃疡的治疗具有丰富的经验，主张清创、控制感染、改善血供、促进创面愈合等非手术治疗手段［8］。

紫草是紫草科植物新疆紫草、紫草或内蒙紫草的干燥根，具有活血凉血、解毒透疹的功效［9］，在血热毒盛、麻疹、疮疡的治疗中具有独特的疗效［10］。紫草及紫草制剂现已广泛用于临床治疗，用于湿疹、皮炎、皮肤创面及黏膜损伤等多种炎症性疾病［11］。紫草素是从紫草中提取的主要成分，具有抗炎、杀菌等效果，也有研究证实其具有抗癌的作用［12］，常用于皮肤疾病的治疗。

溃疡创面愈合率是反映慢性皮肤溃疡疗效最直观的证据［13］，在本次研究中，紫草素组干预7、12 d 后创面愈合率与模型组比较差异无统计学意义（P>0.05），证实其能够有效促进慢性皮肤溃疡愈合，治疗效果与重组牛碱性成纤维细胞生长因子凝胶相当。从溃疡创面肉芽组织HE 染色中可以看出，紫草素组肉芽组织生长良好，炎性细胞浸润减少，进一步印证了紫草素对于慢性皮肤溃疡的治疗效果及其抗炎效果。

间隙连接是相邻细胞进行物质和信息交换的跨膜蛋白通道［14］，主要由Cx构成。营养物质、代谢产物、分子量较小的亲水性物质等均可以通过间隙连接进行交换［15］。间隙连接介导的细胞连接通讯是调控内环境稳定，细胞新陈代谢、增殖分化等生理过程的重要手段。Cx 基因也与多种皮肤病存在密切的联系。Cx 的主要作用有细胞通道、电耦联作用、调控细胞生长与分化及传递胚胎生长、发育中的细胞间信号［16］。Cx26、Cx30、Cx43是Cx家族的关键蛋白，其高水平表达说明细胞之间的信息和物质交换加快，有利于创面的愈合。相关研究也证实，Cx43 对于皮肤伤口愈合的速度和质量具有重要作用［17］。本次研究中，模型组、紫草素组Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 和蛋白表达均低于假手术组，证实Cx26、Cx30、Cx43 在创面愈合中发挥了作用。紫草素组Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 和蛋白表达均高于模型组，提示紫草素可能通过提高Cx 水平促进溃疡皮肤的愈合，提高治疗效果。

本次研究不足之处在于未对紫草素剂量水平展开研究，日后将继续补充相关研究。

综上所述，紫草素治疗慢性皮肤溃疡大鼠效果明显，其作用机制可能与提高间隙连接蛋白水平有关。