染色体平衡易位断裂点与男性不育关系探讨

刘美含，雷立健，杨 潇，丁 玲*

(1.山西医科大学公共卫生学院 流行病学教研室，山西 太原030001；2.吉林大学第一医院 生殖医学中心，吉林 长春130021)

染色体异常与男性不育密切相关，在无精子症患者中约占20%，在少精子症患者中可达8%[1]。平衡易位是常见的染色体结构异常之一，其男性携带者可表现为精液正常且可正常生育；也可能表现为无精子症、少精子症等不育；也可表现为妻子自然流产、不良妊娠史等[2-4]。随着辅助生殖技术的发展，对平衡易位携带者，胚胎植入前诊断(PGD)被推荐为一种有效的选择，可降低流产率，提高临床妊娠率[5]。也有文献报道由于PGD价格昂贵，尝试自然受孕也是一个可行的选择，其活产率远远高于预期；未经治疗的携带者经过5年的追踪随访，其活产率可达60%至70%[6]。最近一篇Meta分析表明，平衡易位携带者能否通过PGD降低流产率，提高妊娠率，不同国家文献报道不一致，也取决于特定的染色体和其断裂点[7]。因此，临床上对平衡易位携带者的遗传咨询尚有一定挑战。

本研究以男性遗传咨询患者为研究对象，包括男性不育患者、女方有反复自然流产或不良孕产史的夫妇、妻子怀孕发现胎儿染色体异常需要行染色体对照的夫妇等进行外周血染色体检查；分析其染色体异常情况，针对染色体平衡易位携带者，进一步探讨其断裂点与不育的关系，为临床遗传咨询提供实验依据。

1 对象和方法

1.1 研究对象

选择2019年1月至2020年12月到吉林大学第一医院生殖男科就诊，且行染色体检查的6111例患者为研究对象，年龄20-49岁。临床收集患者问卷信息、临床诊断等，主要临床表现为：男性原发不育、妻子有反复自然流产、妻子有不良孕产史、妻子怀孕产前诊断检出胎儿染色体异常等。

1.2 仪器和试剂材料

恒温培养箱(型号MIR-162，日本三洋公司)、水浴箱(型号REX-C400，北京市医疗设备厂)、电热干燥箱(型号WOV-212S，日本三洋公司)、自动扫描显微镜和图像分析系统(型号CytoVision GSL-120，德国莱卡公司)、自动细胞收获仪(型号CP-II-32，上海乐辰生物科技有限公司)、普通光学显微镜(型号DM2500，德国莱卡公司)、淋巴细胞培养液(一生骏，广州拜迪生物医药有限公司)、秋水仙素(广州拜迪生物医药有限公司)、甲醇(北京化工厂)、无水乙醇(北京化工厂)、冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司)、吉姆萨染料(鼎国昌盛生物技术有限公司)、胰蛋白酶(1∶250，鼎国昌盛生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1样本采集和保存 所有患者经临床咨询，填写申请单和知情同意书，抽取患者外周血2 ml于绿头肝素抗凝采血管中(含有30 IU/ml肝素)，常规保存于4℃冰箱中，用于接种和淋巴细胞培养。

1.3.2染色体接种、收获与制备 在无菌操作条件下，用1 ml一次性注射器吸取0.8 ml抗凝血注入淋巴细胞培养液中，轻微摇匀后，置于37℃恒温培养箱中培养72 h。收获前2 h，用1 ml注射器加入终浓度为150 μg/ml的秋水仙素，37℃继续培养，此时细胞分裂周期被阻断至有丝分裂中期。将细胞悬液收集至15 ml离心管中，然后置于自动细胞收获仪进行收获，收获程序如下：先1 500 r/min 条件下离心10 min，弃去上清液，加入低渗液8 ml，混匀后继续37℃孵育30 min；后加入新鲜配制的1 ml卡诺固定液(甲醇：冰醋酸=3∶1)，充分吹打混匀，室温静置1 min，2 000 r/min离心5 min，弃上清，再加入6 ml固定液混匀静置后，2 000 r/min离心5 min，此过程重复两次。最后一次固定完成后保留1-2 ml，制备成细胞悬液。

取悬液3-5滴滴至洁净载玻片上，80℃烘烤2 h老化处理。将老化处理后的玻片放入预热好的胰蛋白酶溶液中消化处理，具体时间根据效果调整，迅速用0.9%生理盐水冲洗，吉姆萨染色2 min，自来水冲洗并室温凉干备用。

1.3.3核型分析 将制备完成的核型玻片上自动扫描显微镜和图像分析系统进行扫片，然后进行阅片核型分析。每个样本计数20个中期分裂相，分析6个核型，按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)判读染色体核型结果。

1.4 易位断裂点相关基因检索

为了进一步分析易位断裂点与男性不育的关系，检索易位断裂点及其相关基因。检索应用网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim，检索式为“具体断裂点+sperm”。根据检索结果，分析断裂点与精子发生、男性不育的关系。

2 结果

2.1 男性咨询者的染色体异常统计

在6111例男性不育患者中，共计检出染色体异常475例，检出率为7.77%(475/6111)。在异常染色体中，多态性核型为最多，313例(65.9%)。47,XXY为 59例(12.4%)；平衡易位48例(10.1%)；倒位22例(4.6%)；罗氏易位18例(3.8%)；嵌合体9例(1.9%)；47,XYY为5例(1.1%)；47,XY,+mar为2例(0.4%)；46,XX男性为2例(0.4%)。

2.2 染色体平衡易位携带者及其临床表现

有文献报道将男性不育分为受孕前型不育(pregestational infertility)，其特征是不能受孕、未能产生受精卵；受孕型不育(gestational infertility)，其特征是受精后胚胎丢失[8]。前者与无精子症、少精子症或少弱精子综合征等有关，后者与发育性早孕丢失、反复自然流产和死产等有关。本文48例男性染色体易位携带者中，表现为无精子症、少精子症、弱精子症、原发不育的患者共计22例，属于受孕前型不育；表现为不良孕产史、妻子孕异常儿、胚胎停育、精液正常患者共计26例，属于受孕型不育。具体核型及临床表现见表1。

2.3 染色体平衡易位断裂点与相关基因的关系

经检索OMIM易位断裂点与精子相关的基因，发现39个易位断裂点与26个基因相关，这26个基因分别与男性原发不育、无精子症、弱精子症等相关，具体基因与所对应的断裂点见表2。

表1 染色体易位男性携带者及其临床表现

3 讨论

在有正常性生活、未采取避孕措施一年或更长时间的夫妇中，15%夫妇会经历不孕不育，其中男性因素不育占50%[35]。随着遗传学技术的发展，男性不育病因的阐明也取得了一定进展。明确遗传病因，可有针对性的应用相关治疗方案；遗传病因不明，治疗方案也不明。染色体异常是男性不育最常见的遗传因素，细胞遗传学检测可为不育男性的遗传咨询提供有价值的信息。临床上最多的数目异常为47,XXY，结构异常包括平衡易位、罗氏易位、倒位等[36]。不育男性的平衡易位发生率大约是普通人群的10倍。本文6111例男性不育患者中，染色体异常检出率为7.77%，其中47,XXY占12.4%；平衡易位占10.1%。

染色体平衡易位可能导致断点处遗传物质丢失，并可能导致精子发生失败。受这种易位影响的个体表现出一些生殖问题，如不育、反复自然流产和胎儿出生缺陷等[37]。这些影响效应通常与易位所涉及的特定染色体和断裂点有关；一些断裂点可以破坏生精相关重要基因的结构，导致精子发生或成熟障碍，以及男性不育[38]。针对受孕型不育，本文检测出48例男性染色体易位携带者中，共计26例表现为不良孕产史、妻子孕异常儿、胚胎停育等患者。这些患者精液分析正常，其妻子能受孕，但有不良孕产史；进一步分析染色体易位断裂点，包括1p34，1p32，2p25，2q13，2q23，2q33，3p24，3p23，3p13，3p21，3q13，4p14，4q12，4q23，4q33，4q35，5p13，5q13，6p21，6q15，6q21，6q25，7p13，8q24，9p22，9p23，10p13，10q11，10q22，10q26，11p15，11q23，12p11，13q14，14q22，14q32，15q11，15q15，15q22，15q26，16p13，16q23，17q23，18q12，18q21，18q23，19q13，22q13。根据文献报道，染色体平衡易位携带者有两种选择：一种是行PGD，另一种是继续尝试自然受孕[6]。Fischer等学者[39]报道经历3次或3次以上流产的易位携带者可通过PGD受益，降低流产率，提高妊娠率，怀孕时间缩短。Scriven等[40]报道PGD可通过降低流产风险和避免不平衡易位妊娠而使易位携带者受益。然而，也有学者报道有63.0%的易位携带者在尝试自然受孕后成功活产，自然受孕的累计活产率为65%-83%[41]。因此，针对受孕型不育的易位断裂点可能不影响精子发生，其妻子能够受孕。这些携带者可以考虑尝试进一步自然受孕，但要行产前诊断。

表2 受孕前不育携带者易位断裂点与相关基因的关系

针对受孕前型不育，本文检出48例男性染色体易位携带者中，共计22例表现为无精子症、少精子症、弱精子症、原发不育患者。经检索OMIM易位断裂点与精子发生相关的基因，发现39个易位断裂点与26个基因相关，这26个基因分别与男性原发不育、无精子症、弱精子症等相关。结合基因功能分析发现，SPATA46，CATSPER3，SPGF7，JAM3，CDADC1，SPGF36，ADAM21，SPGF30，SPGF27，SPGF1，TSSK2，SPGFX3基因可能与精子发生相关，可直接导致无精子症或严重少精子症；SMCP，SPGF34，SPGF18，DNAH5，MOSPD3，DNAH11基因可能与弱精子症相关；OAZ3，ADAD1，SPGF10，SPGF31基因可能与畸形精子症有关；而SPACA1，IZUMO1R，ACR基因可能与受精功能相关，即使是精子参数正常，也可能不能受精，可能与原发性不育有关。这些基因对应的易位断裂点包括1q21，1q23，2q32，3p21，4q27，5q31，5p15，6q15，7q22，7p15，11q13，11q25，11q21，13q14，14q13，14q24，14q32，16p13，16q22，17p11，20q13，22q11，22q13，Xp21。根据基因与表型的关系，结合本文病例分析，以下基因与临床表型一致，如：SMCP基因定位在染色体1q21，与弱精子症密切相关[9]。SPATA46基因定位在染色体1q23，是精子发生所必需的；基因结构改变可能导致无精子症发生[11]。ADAD1基因定位在4q27,与畸形精子症有关[14]。CATSPER3基因定位在5q31，是精子特异性离子通道，可能与精子发生密切相关[15]。SPGF7基因定位在11q13，与男性不育相关[20]。JAM3基因定位在11q25，与男性不育有关[21]。CDADC1基因定位在13q14，调节睾丸发育与精子发生，可能导致无精子症发生[23]。SPGF36基因定位在14q13，与精子发生有关[24]。SPGF30基因定位在14q32，变异导致非梗阻性无精子症[26]。SPGF1基因定位在20q13，可能与少弱精子症有关[31]。TSSK2基因定位在22q11，在睾丸特异性表达，其功能值得进一步研究[32]。ACR基因定位在22q13，与受精有关，表达顶体酶，与原发性不育密切相关[33]。SPGFX3基因定位在Xp21，与男性原发性不育有关[34]。以上结果和文献提示，染色体易位断裂点可能影响其相关基因结构或功能，影响精子发生或精子功能，最终导致男性不育。经过与受孕型不育相对比，有3p21，6q15，13q14，22q13四个位点出现在二种不育类型中，因此推测这四个断裂位点不影响精子发生，应重点考虑易位的另一条染色体断裂点。另外，这些断裂点可能直接导致精液参数改变，难以完成自然受孕，建议这类夫妇直接选择PGD辅助生殖技术助孕。

染色体易位导致男性不育的机制目前尚不清楚，针对当前研究可总结为：①易位携带者减数分裂障碍导致精子发生失败，存在配子形成问题，导致不育[42]；②染色体平衡易位携带者产生不平衡的配子，导致反复自然流产，降低生育能力[42]；③特定染色体和易位中涉及的断裂点破坏精子发生重要基因的结构，导致男性不育[42]；④染色体重排破坏或失调对生育重要的基因[43-44]。因此，关注和研究易位染色体断裂点，一方面可以为临床遗传咨询提供理论基础，另一方面可能发现与精子发生或成熟相关的基因，因此值得进一步深入研究。

综上所述，本文报道染色体平衡易位断裂点与男性不育关系，发现染色体易位断裂点1q21，1q23，4q27，5q31，11q13，11q25，14q13，14q32，20q13，22q11，Xp21与受孕前型不育相关，这类携带者夫妇应该直接选择PGD助孕。其他染色体断裂点与受孕型不育相关，可以考虑PGD助孕或自然受孕后行产前诊断。在临床遗传咨询中，这些特定的染色体和断裂点应该受到关注。