基于非极性柱气质联用测定脂肪酸差异鉴别动物油脂

刘娜，靳林溪*，王伟

天津春发生物科技集团有限公司，天津市风味食品配料企业重点实验室（天津 300300）

随着人们生活水平的提高，食品工业的迅速发展，动物肉类及其油脂的需求量也在逐年增加。由于不同种类和来源的动物油脂质量及价格差异较大，为追求利益，市场上出现了违法添加[1-2]等不良事件，威胁消费者的生命健康[3]。因此，有必要建立一种科学、有效、实用的动物油脂鉴定方法。

动物油脂的质量与营养价值与其脂肪酸组成及分布有关[4]，每一种动物油脂中的脂肪酸都有各自组成及含量，因此可以通过脂肪酸特征辨别动物油脂类别。目前食品中脂肪酸的测定方法主要包括气相色谱法[5-6]、高效液相色谱法[7]、红外光谱法[8]、核磁共振法[9]和生物学方法等[10]。气相色谱质谱（GC-MS）联用法[11-12]测定脂质的脂肪酸组成是近年来兴起的分析方法，可以实现对脂质的脂肪酸组成进行快速定性和定量。当前脂肪酸气相及气质测定多采用极性色谱柱，目前鲜见使用非极性柱进行食品中脂肪酸甲酯分离测定的报道。GC-MS[13-14]联用法在食品香气分析中发挥着巨大的作用，经常应用弱极性、非极性色谱柱进行风味物质挥发性成分的分析，在风味解析、模拟及创新中为产品开发提供理论指导[15]。为了进行油脂食品风味研究及开发，研究其风味物质和油脂组成，在同一台GC-MS上实现香气分析和脂肪酸测定的同时测定，有必要建立一种应用非极性柱分析脂肪酸的方法。

此次试验建立了非极性色谱柱-气质联用仪分析不同动物油脂脂肪酸的组成及含量方法。通过比较不同油脂脂肪酸信息的差异，应用主要脂肪酸比值法和全脂肪酸聚类分析法快速对鸡、猪、牛和羊四种应用较多的动物油脂进行鉴别，实现风味物质分析与脂肪酸测定方式的同时测定，避免更换色谱柱，节省研发时间，提高工作效率。适宜相关企业进行产品研发及质量监控，具有较好的应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

鸡油、精炼鸡油、鸡骨油、猪油、精炼猪油、猪骨油、牛油、精炼牛油、牛骨油、羊油、精炼羊油及羊骨油（市售）；正己烷、甲醇（色谱纯，美国默克公司）；碳酸氢钠、氢氧化钾（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；37种脂肪酸甲酯混标品（美国西格玛公司）。

1.2 仪器与设备

6890-5975 型气相色谱-质谱联用分析仪、7683B型自动进样器（美国安捷伦科技有限公司）；XS205型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；vortex genie 2漩涡混合器（美国SI公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

称取50 mg油脂样品于5 mL正己烷的具塞玻璃试管中，放入超声波振荡器中于40 ℃超声10 min处理。加入2 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液3 mL，涡旋混合1 min，于60 ℃水浴酯化30 min，静置至澄清，加入1 g碳酸氢钠，中和过量的氢氧化钾。使用0.2 μm的针头过滤器过滤，待测[16-17]。

1.3.2 GC-MS分析条件

GC条件：色谱柱：Hp-5MS弹性石英毛细管色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），进样口温度：250℃，载气：高纯（≥99.999%）氦气，载气流速：1.0 mL/min，进样量0.4 μL，分流100∶1；升温程序设置为：40 ℃保持2 min，以30 ℃/min升温至220 ℃，4 ℃/min升温至250 ℃，以0.5 ℃/min升温至254 ℃，以15℃/min升温至280 ℃保持10 min。

MS条件：EI源，电子能量70 eV，电子倍增器电压1 354 V，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度260 ℃，质量扫描范围：m/z35~450，溶剂延迟8 min。采用全扫描模式。

1.4 定性定量方法

采用37种脂肪酸甲酯混合标准溶液和NIST 17质谱数据库进行脂肪酸定性分析，使用面积归一化法进行样品中脂肪酸定量分析。

1.5 数据处理方法

按照样品中脂肪酸定性定量结果，分别选取主要脂肪酸和全脂肪酸根据比值法和K-均值聚类分析法进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酸甲酯混合标准品定性

37种脂肪酸甲酯混合标准溶液按照1.3.2条件进样分析，总离子流图如图1所示。

图1 脂肪酸甲酯混标总离子流图

图1的33个色谱峰多数分离度良好，结合数据库检索、保留时间、特征离子等信息，可定性29种脂肪酸甲酯。峰号16，17，18和29这4个色谱峰峰纯度不为1，需要进一步分析。17号峰中，保留时间20.105 min的质谱数据进行谱库检索比对，检出物质为亚油酸甲酯（匹配度915）；保留时间20.117 min的质谱数据进行谱库检索比对，检出物质为反式亚油酸甲酯（匹配度887），同时结合其定性离子及其丰度比（表1）进行特征离子扫描，特征离子丰度比存在差异，判定17号峰为亚油酸甲酯和反式亚油酸甲酯的共流出峰。按照相同方法，判断16峰为γ-亚麻酸甲酯和亚麻酸甲酯的共流出峰，18号峰为油酸甲酯和反式油酸甲酯的共流出峰，29号峰为芥酸甲酯和二十二碳二烯酸甲酯的共流出峰。

表1 8种脂肪酸甲酯定性离子表

37种脂肪酸甲酯混标经过非极性色谱柱气质联用分析，具体脂肪酸定性结果详见表2。

表2 脂肪酸甲酯混标定性表

接表2

2.2 动物油脂样品中脂肪酸测定

12种油脂样品按照1.3方法进行脂肪酸分析，每个样品平行测定5次，按照1.3方法进行定量，结果以平均值±标准偏差表示，得到油酯样品脂肪酸的组成和含量，详见表3和表4。

表3 鸡油和猪油中脂肪酸相对含量 单位：%

表4 牛油和羊油中脂肪酸相对含量 单位：%

接表4

2.3 动物油脂中脂肪酸组成特征分析

结合表3和表4，四种油脂脂肪酸集中在碳原子数为8~20间，鸡、猪、牛类油脂最多检测出17种脂肪酸，羊类油脂最多检测出19种脂肪酸。

四种油脂主要脂肪酸均为棕榈油酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸（可能包含反式）以及油酸（可能包含反式）的偶碳数脂肪酸，约占总脂肪酸的90%，其主要脂肪酸组成和相关文献报道一致的[19-20]。另外，四种油脂含有少量的奇碳数脂肪酸，主要是C15∶0、C17∶0、C17∶1，羊类油脂中检出C13∶0。四种油脂均检出C17∶0，这是相关文献报道的动物油脂的主要特征指标[21]。

2.4 不同动物油脂中脂肪酸识别

2.4.1 主要脂肪酸比值法

选取以C16∶1和C16∶0的峰面积百分比的比值作为横坐标[22]，以C18∶1和C18∶2之和与C18∶0的峰面积百分比的比值作为纵坐标，应用Origin 6.0软件绘制散点图。

图2显示，四类动物油酯都有各自的分布区域，无重叠区，且坐标位置有差异。猪、牛、羊类油脂区域毗邻，图3说明三种实际分布在不同区域，与鸡油有明显的区分，鸡油横纵坐标均较大，牛油横纵坐标均较小，纵坐标值小大接近的猪类和羊类油酯，其横坐标存在差异，可独立分布，按主要脂肪酸比值法确定的数据见表5。应用主要脂肪酸比值法对于识别四种油脂是可行的，能够区分四种动物油脂。

图2 四种油脂以主要脂肪酸比值为特征的散点图

图3 三种油脂以主要脂肪酸比值为特征的散点图

表5 主要脂肪酸比值法坐标范围值

2.4.2 全脂肪酸聚类分析

应用主要脂肪酸比值法，猪、牛和羊油脂较为集中，为避免样品出现边界数值可能出现的误判，提高辨识准确度，使用全脂肪酸聚类分析进行辅助验证。

试验采用SPSS 19.0对猪、牛和羊三种油脂中的全脂肪酸数据进行K-均值聚类分析，样品随机排列后以案例顺序命名，聚类数为3，方法采用迭代和分类，初始中心间的最小距离为15.804，比对猪、牛和羊油脂中，没有的脂肪酸的含量为0，经过3次迭代后，聚类结果见表6，最终聚类中心间距离见表7。

表7显示，1和2类距离最远，1和3距离次之，2和3距离最近，即牛羊聚类中心差距最远，牛猪聚类中心差距居中，羊猪聚类中心差距最小，这与前面主要脂肪酸比值法一致。表6显示，猪、牛和羊类油酯被聚成三类，没有出现误判现象。由此可见，选取全脂肪酸信息进行三种油脂聚类，效果较好。

表6 基于全脂肪酸的K-均值聚类分析

表7 最终聚类中心间的距离

3 结论

建立了非极性色谱柱-气质联用仪分析不同动物油脂中的脂肪酸的组成及含量方法，通过比较不同油脂脂肪酸的差异信息，研究脂肪酸特征辨别不同动物油脂的方法，能够快速对鸡、猪、牛和羊四种动物油脂进行鉴别。主要脂肪酸比值法选取以C16∶1和C16∶0的峰面积百分比的比值作为横坐标数据，以C18∶1和C18∶2之和与C18∶0峰面积百分比比值做为纵坐标，按照散点图进行识别。若样品测定数据位于边界点，可采用全脂肪酸数据进行K-均值聚类分析，进行猪、牛、羊三类动物油脂鉴定。两种方法在进行鸡、猪、牛和羊四种动物油脂鉴别中具有一定可行性。

该法在非极性色谱柱气质联用仪上实现风味物质分析与脂肪酸甲酯测定的同时测定。方法操作简单、省时高效、分析成本低，在食品行业产品开发中具有一定的应用前景。