百里香醌对高血脂症心肌损伤保护作用的研究

刘颖姝，姚 薇，李 珅，李欣宇，刘栩晗，王 冰，刘明明，张婷婷，华黎黎，高政南

(1. 大连理工大学附属中心医院，辽宁 大连 116021；2. 大连医科大学，辽宁 大连 116044；3. 大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116001)

高血脂症是动脉粥样硬化性疾病、心肌梗死及卒中的独立危险因素[1]。近年来研究发现，高血脂症与炎症反应、氧化应激反应密切相关，会导致心肌细胞受损，引发心血管疾病[2]。目前临床上治疗高血脂症的药物主要为西药化学制剂，包括他汀类、贝特类、烟酸及其衍生物等，这些药物均有一定的不良反应。中医药降血脂具有多靶点、多途径的特点，因此从中草药中提取有效成分，探寻预防和保护高血脂症对心肌损伤的新药有重要意义。百里香醌是一种从黑种草子中提炼出来的生物活性单体，是亲氧化剂，具有抑制炎症和氧化应激反应、抗缺血和抗血小板凝聚作用，对癌症、肝脏疾病、糖尿病、心力衰竭、脏器缺血等多种疾病显示出保护作用[3-7]，但其对高血脂症心肌病变保护作用的研究较少。低密度脂蛋白受体基因敲除(LDLR-/-)小鼠因LDLR被敲除或沉默影响胆固醇的转运，影响脂蛋白的摄取和清除，给予高脂饮食可诱发高血脂症所致的病变[8]，因此本研究采用该小鼠探索了百里香醌对高血脂症的心肌保护作用及其可能的机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 雄性LDLR-/-小鼠24只，体重(26.3±3.1)g，8周龄，购自北京维通利华实验动物科技有限公司，动物合格证号：114007004738296。小鼠饲养条件：恒定温度(24～26 ℃)，湿度50%～70%，标准小鼠笼饲养,5只/笼,12 h明暗交替,自由饮水。所有实验程序均符合《国家实验动物管理条例》和《大连市中心医院实验动物管理条例》的规定。

1.2药物 百里香醌购于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，批号：274666-1G。

1.3主要试剂及仪器 总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)，兔抗清道夫受体(SR)抗体、兔抗CD36抗体、兔抗CD68抗体、兔抗过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)抗体、兔抗核因子E2相关因子2(Nrf2)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，兔抗血红素加氧酶-1(HO-1)抗体、兔抗Smad3抗体(北京索莱宝科技有限公司),一抗稀释剂(碧云天生物技术有限公司),抗兔通用型免疫组化检测试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司)；生物组织自动脱水机、石蜡包埋机及生物组织摊烤片机购自中国上海徕卡仪器有限公司，全波长酶标仪购自美国伯乐公司，倒置生物显微镜购自日本Olimpus公司。

1.4实验方法 将24只雄性LDLR-/-小鼠平均随机分为3组：正常组给予普通饮食，高脂组、高脂+百里香醌组参考文献[9]给予高脂饮食(含有1.2%的胆固醇和21%的脂肪)，高脂+百里香醌组同时给予百里香醌50 mg/(kg·d)溶解在玉米油溶液中灌胃，3组均干预8周。

1.5观察指标及方法

1.5.1体重、代谢及炎症相关指标 干预8周结束后称量3组小鼠体重；麻醉小鼠，下腔静脉取血，3 000 r/min离心15 min收集血液样本，测定血清TC、LDL-C和hs-CRP水平。

1.5.2心肌组织HE染色病理观察 取血后处死3组小鼠，取心脏组织，用10%福尔马林固定30 min,75%乙醇脱水过夜，石蜡包埋。将包埋的石蜡组织块切成4 μm厚的石蜡切片，进行HE染色后观察：细胞核呈蓝色，细胞质呈红色。

1.5.3心肌组织Masson染色病理观察 取10%福尔马林固定的心脏组织，分别用75%，85%，90%，100%乙醇逐级脱水5 min，然后用石蜡包埋。将包埋的石蜡组织块切成4 μm厚的石蜡切片，在二甲苯中浸泡3次，每次5 min，脱蜡后再用100%，90%，85%，75%乙醇水化，每次5 min，进行Masson染色后观察：胶原纤维呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。

1.5.4心肌组织中脂质沉积相关蛋白、氧化应激相关蛋白及Smad3表达情况 心脏组织切片经脱蜡、水化、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭后，根据组织大小滴加按比例稀释后的一抗[SR(1∶200)、CD36(1∶200)、CD68(1∶200)、PPAR-α(1∶200)、Nrf2(1∶350)、HO-1(1∶100)、Smad3(1∶100)]，切片平置于4℃湿盒内过夜，后PBS冲洗 5 min×3次；滴加100 μL的生物素标记山羊抗兔IgG，室温孵育30 min后，PBS洗涤5 min×3次；滴加100 μL的辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温30 min后，PBS洗5 min×3次；DAB 显色、复染细胞核、脱水封片。在显微镜下,每一张切片均手动调节曝光和增益值在同一环境,随机选取≥5个视野采集照片,采用Image J图像分析软件分析SR、CD36、CD68、PPAR-α、Nrf2、HO-1和Smad3阳性表达情况。结果判读：苏木素染细胞核为蓝色，各蛋白阳性表达DAB显色为棕黄色。

2 结 果

2.13组小鼠体重及血清TC、LDL-C、hs-CRP水平比较 干预8周后，3组小鼠体重比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；高脂组血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均明显高于正常组(P均<0.05)，高脂+百里香醌组血清TC、LDL-C、hs-CRP水平均明显低于高脂组(P均<0.05)。见图1。

图1 各组小鼠体重及血清TC、LDL-C、hs-CRP水平

2.23组小鼠心肌组织 HE染色情况 高脂组小鼠心肌组织有大量炎性细胞浸润，高脂+百里香醌组小鼠心肌组织炎症细胞浸润较少。见图2。

箭头处为炎性细胞浸润图2 各组小鼠心肌组织HE染色表现(×40)

2.33组小鼠心肌组织Masson染色情况 高脂组小鼠心肌组织中存在明显胶原纤维沉积，高脂+百里香醌组胶原纤维沉积较高脂组少。见图3。

箭头处为胶原纤维沉积情况图3 各组小鼠心肌组织Masson染色表现(×40)

2.43组小鼠心肌组织中SR、CD36和CD68表达情况 高脂组小鼠心肌组织中SR、CD36和CD68阳性表达率均明显高于正常组(P均<0.05)，高脂+百里香醌组小鼠心肌组织中SR、CD36和CD68阳性表达率均明显低于高脂组(P均<0.05)。见图4及图5。

箭头处为染色阳性的细胞图4 各组小鼠心肌组织中脂质沉积相关蛋白表达情况(免疫组化染色，×40)

图5 各组小鼠心肌组织中SR、CD36和CD68阳性表达率

2.53组小鼠心肌组织中PPAR-α、Nrf2和HO-1表达情况 高脂组小鼠心肌组织中PPAR-α、Nrf2和HO-1阳性表达率均明显低于正常组(P均<0.05)，高脂+百里香醌组小鼠心肌组织中PPAR-α、Nrf2和HO-1阳性表达率均明显高于高脂组(P均<0.05)。见图6及图7。

箭头处为染色阳性的细胞图6 各组小鼠心肌组织中氧化应激相关蛋白表达情况(免疫组化染色，×40)

图7 各组小鼠心肌组织中PPAR-α、Nrf2和HO-1阳性表达率

2.63组小鼠心肌组织中Smad3表达情况 正常组、高脂组、高脂+百里香醌组小鼠心肌组织中Smad3阳性表达率分别为1.0%，4.79%，2.26%，高脂组明显高于正常组(P<0.05)，高脂+百里香醌组明显低于高脂组(P<0.05)。见图8。

箭头处为染色阳性的细胞图8 各组小鼠心肌组织中Smad3表达情况(免疫组化染色，×40)

3 讨 论

hs-CRP为一种炎症生物标志物，根据其水平可预测心血管疾病风险[10]。CD68为巨噬细胞标记物，可识别巨噬细胞；CD36、SR为脂蛋白标记物，可反映脂质沉积情况[11-12]。LDL-C主要由SR调节，SR介导了巨噬细胞对氧化或乙酰化修饰LDL-C的摄取代谢[13]。本实验观察到，高脂组LDLR-/-小鼠血清TC、LDL-C、hs-CRP水平和心肌组织中CD68、CD36、SR阳性表达率均显著高于正常组。证实高脂饮食可导致LDLR-/-小鼠出现严重的高血脂症及心肌组织脂质沉积，会引发严重的炎症反应及心肌损伤，这与既往研究高脂血症可促进心肌组织巨噬细胞积聚和脂质沉积的结果一致[14]。本实验依据文献和本团队先前研究[4，6-7，9]，选取百里香醌50 mg/(kg·d)为干预剂量，结果高脂+百里香醌组LDLR-/-小鼠血清TC、LDL-C、hs-CRP水平和心肌组织中CD68、CD36、SR阳性表达率均显著低于高脂组。提示百里香醌可减轻炎症反应，降低血脂[15]，抑制脂质沉积，从而对高脂血症所诱导的心肌损伤起到保护作用。

氧化应激在高血脂症引起的心肌损伤中起关键作用。PPAR-α是参与TC和三酰甘油代谢的主要调节剂[16]。Nrf2是维持氧化平衡的关键调节因子，其参与下游抗氧化酶转录表达的启动，通过抗氧化、抗炎和自噬机制来保护心肌[17-18]。氧化应激存在时，Nrf2被激活解离后转位于细胞核内，与抗氧化反应元件(ARE)结合后诱导包括HO-1等抗氧化酶基因的转录和表达[19]。HO-1 是心肌中一种重要的内源性保护因子,具有抗氧化和抗凋亡作用，其表达增加可抑制心肌细胞凋亡[20-21]。Dong等[22]发现，百里香醌可通过Nrf2/ARE通路减轻氧化应激来保护神经。本实验中，高脂组小鼠心肌组织中PPAR-α、Nrf2和HO-1阳性表达率均明显低于正常组，高脂+百里香醌组均明显高于高脂组。提示百里香醌可促进心肌Nrf2及其下游抗氧化酶靶基因HO-1蛋白表达而减轻高脂饮食诱导的心肌氧化应激损伤。

心肌纤维化会导致心脏收缩和舒张功能障碍，其病理表现是心肌组织中胶原成分过度沉积伴异种胶原蛋白比例失衡[23-24]。Smad蛋白参与调节心肌成纤维细胞的增殖、转化、迁移，是促心肌纤维化的最主要因子[25-26]。本实验中，Masson染色显示高脂组小鼠心肌组织中有大量胶原沉积，Smad3阳性表达率明显高于正常组；高脂+百里香醌组小鼠心肌组织中胶原沉积较少，Smad3阳性表达率明显低于高脂组。表明百里香醌可减轻由高血脂症引起的心肌纤维化。

综上所述，百里香醌可能通过抗炎症、抗脂质沉积、抗氧化应激和抗心肌纤维化的作用而保护高血脂症所诱导的心肌损伤，其是一种潜在的改善高血脂症引起心损伤的药物。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。