宣肺平喘胶囊基于p38磷酸化途径对COPD自噬影响研究

张 晔，薛晓明，孟丽红，李 豪，李 典，乔文晓

(1. 山西中医药大学，山西 太原 030002；2. 山西省中医院，山西 太原 030012 )

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种主要由吸烟等原因引起的气道和(或)肺泡异常，导致以咳嗽、咳痰及气喘为主要表现的炎症性肺病，是全球发病率和病死率最高的疾病之一[1]。研究发现，吸烟是COPD的首要危险因素，其他危险因素还有空气污染、固体燃料、职业暴露和铜绿假单胞菌等[2-3]。目前COPD的传统治疗包括吸入糖皮质激素及支气管扩张剂，但其可能引发一系列不良反应，如加重感染、骨质疏松、白内障等[4]，还会给患者带来沉重的经济负担，因此，寻求治疗COPD的新方法是有必要的。COPD发病机制的分子机制尚不完全清楚[5]，大量研究表明在COPD患者的肺上皮细胞、小鼠模型和细胞培养模型系统中，自噬异常激活，且持续或无效的自噬可能对肺上皮细胞有害，促进肺损伤，另外香烟诱导的自噬功能障碍加速了肺老化和COPD肺气肿的加重和发病[6-8]，这都表明自噬与COPD的气道重塑、肺实质改变等密切相关，为临床上治疗COPD提供了新靶点。COPD属于中医学中“肺胀”范畴，其病性为本虚标实。宣肺平喘胶囊是山西省中医院中成药制剂，其对痰瘀阻肺证COPD 有明确疗效。本研究旨在探讨该药是否可通过抑制p38磷酸化对香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞自噬产生影响。

1 实验材料与方法

1.1药物 宣肺平喘胶囊由炙麻黄10 g、杏仁10 g、黄芩10 g、苏子10 g、桔梗10 g、桑白皮15 g、紫菀15 g、款冬花15 g、葶苈子10 g、半夏10 g、甘草6 g、五味子10 g、白果10 g、当归15 g、黄芪30 g、蛤蚧1对组成，由山西省中医药研究院制剂室提供。

1.2试剂与仪器 支气管上皮细胞株购自杭州立效生物医药科技公司，Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒(Cell Signaling Technology，批号C0037，C1075M)，CCK-8试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：CA1210)，LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1抗体(北京索莱宝科技有限公司，货号分别为K200040、K008014P、K101553P)，p38、p-p38抗体(Cell Signaling Technology，批号8690T、4511T)，TRIzol试剂(赛默飞世尔科技，批号：10296010)，DNA using the PrimeScript RT Reagent Kit (Takara Bio Inc., Shiga, Japan， ab6721)；蛋白提取试剂盒(北京基普生物科技有限公司，货号：GPP1815)，ECL 发光试剂盒(北京基普生物科技有限公司，货号：GPP1824)。BC-J160S 型细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；M340651 型酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Attune 流式细胞仪(美国赛默飞世尔科技公司)；BX53 型荧光显微镜(日本Olympus 公司)；CFX96型Real-time PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)；ReadMax1800 型全波长型酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1细胞培养 将支气管上皮细胞在含有10%胎牛血清(FBS)、50 IU/mL青霉素G钠和50 μg/mL硫酸链霉素的DMEM中进行培养，在37 ℃下 5%CO2条件下孵育，每2 d换液1次，并进行传代培养。所有实验均取对数生长的细胞。

1.3.2香烟烟雾提取物制备 将1支去过滤嘴燃烧的香烟由负压吸引装置连续抽吸，烟雾经三通阀门导入25 mL无血清的DMEM培养基中制成悬液，用1 mol/L NaOH调pH=7.4，通过0.22 μm的滤器过滤除菌，得到的香烟烟雾提取物悬液定义为100%。

1.3.3含药血清制备 选取12只健康SD大鼠，随机平均分为空白组、宣肺平喘低剂量组、宣肺平喘中剂量组、宣肺平喘高剂量组。空白组灌胃生理盐水，宣肺平喘低、中、高剂量组分别灌胃2.7 g/kg、5.4 g/kg、10.8 g/kg宣肺平喘胶囊溶液，2次/d，共5 d。于末次灌胃后1 h，乙醚麻醉大鼠，无菌条件下经腹主动脉取血，静置1 h，4 ℃ 3 000 r/min离心15 min， 取上清。56 ℃水浴30 min 灭活血清，微孔滤膜过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.3.4细胞分组及干预方法 将支气管上皮细胞分为空白组、香烟烟雾提取物组、宣肺平喘低剂量组、宣肺平喘中剂量组、宣肺平喘高剂量组，空白组以空白血清干预，宣肺平喘各组分别加入相应剂量宣肺平喘含药血清干预，培养6 h、12 h、18 h、24 h。收获细胞，-80 ℃保存备用。每组3个复孔，每实验重复3次。

1.3.5检测指标及方法

1.3.5.1CCK-8法检测细胞活力 以每孔5 000个细胞的初始密度将细胞种植在96孔板上，附着过夜。在香烟烟雾提取物暴露前1 h，用不同剂量宣肺平喘含药血清预处理细胞。24 h后加入10 μL CCK-8试剂继续培养2 h，采用全自动酶标仪在450 nm处检测各孔细胞吸光度。实验重复3次。

1.3.5.2流式细胞术检测细胞凋亡情况 将不同剂量宣肺平喘含药血清与香烟烟雾提取物刺激支气管上皮细胞共孵育5 h后，收集细胞，PBS洗涤3次，冷藏于500 μL 1×缓冲液中重悬，与5 μL Annexin-V- FITC和2.5 μL PI试剂混合均匀，室温避光孵育10 min，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。

1.3.5.3免疫组化检测自噬情况 香烟烟雾提取物处理细胞24 h后，将不同浓度的宣肺平喘含药血清与香烟烟雾提取物刺激支气管上皮细胞共孵育5 h，然后用PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定15 min，再用PBS洗涤3次。用0.5% TritonX-100孵育细胞20 min，PBS洗涤3次，摇匀。用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭细胞60 min，加入一抗(LC3B)，4 ℃振荡孵育一夜，然后用 TBST冲洗细胞。加入二抗，细胞孵育过夜,用荧光显微镜观察细胞。

1.3.5.4Western blot法 检测细胞中p38、p-p38、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表达情况收集各组细胞，提取总蛋白，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，取上清液，BCA试剂盒测定总蛋白浓度；制备基础胶和分离胶；每个梳子孔加入30 μg总蛋白，电泳90 min；转膜至PVDF膜，剪切蛋白条带；封闭；4 ℃过夜孵育一抗；TBST清洗；二抗孵育2 h；TBST清洗；ECL显色。一抗和二抗按照抗体说明书进行稀释。

1.3.5.5RT-PCR法 检测细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1 mRNA表达情况，使用TRIzol试剂提取细胞中的总RNA，并参照说明书使用Prime Scriptr RT试剂盒反转录成cDNA。使用SYBRr Premix Ex TapTM Ⅱ对cDNA样品进行RT-PCR。反应条件：95 ℃，30 s；40个PCR循环[95 ℃ 5 s,60 ℃ 40 s(收集荧光)]。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，95 ℃ 10 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s；并从60 ℃缓慢加热到99 ℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05 ℃/s)。每个样本的目的基因和内参基因分别进行 RT-PCR反应，每个样本检测3个复孔。 数据由QuantStudio 7 Flex检测系统分析。

2 结 果

2.1各组细胞活力 香烟烟雾提取物组及宣肺平喘各组细胞活力均明显低于空白组(P均<0.05)，宣肺平喘高剂量组明显高于香烟烟雾提取物组(P<0.05)，但宣肺平喘各组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 空白组和香烟烟雾提取物各组支气管上皮细胞活力

2.2各组细胞凋亡情况 香烟烟雾提取物组及宣肺平喘各组细胞凋亡率均明显高于空白组(P均<0.05)，宣肺平喘中、高剂量组均明显低于香烟烟雾提取物组(P均<0.05)，宣肺平喘中、高剂量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 空白组和香烟烟雾提取物各组支气管上皮细胞凋亡率

2.3各组细胞中自噬表达水平 香烟烟雾提取物组及宣肺平喘各组均出现明显细胞自噬，自噬小体积累，LC3-Ⅱ-GFP阳性细胞表达率均明显高于空白组(P均<0.05)，但宣肺平喘各组LC3-Ⅱ-GFP阳性细胞表达率均明显低于香烟烟雾提取物组(P均<0.05)，且宣肺平喘低、中、高剂量组呈剂量依赖性降低，两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图3 空白组和香烟烟雾提取物各组支气管上皮细胞自噬指标LC3-Ⅱ-GFP阳性细胞表达情况

2.4各组细胞中p38、p-p38蛋白表达情况 香烟烟雾提取物组及宣肺平喘各组细胞中p-p38 蛋白表达量均明显高于空白组(P均<0.05)，p38蛋白表达量与空白组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；宣肺平喘各组细胞中p-p38 蛋白表达量均明显低于香烟烟雾提取物组(P均<0.05)，且宣肺平喘中、高剂量组均明显低于宣肺平喘低剂量组(P均<0.05)。见图4。

图4 空白组和香烟烟雾提取物各组支气管上皮细胞中p38、p-p38 蛋白表达情况

2.5各组细胞中自噬相关指标LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表达情况 香烟烟雾提取物组及宣肺平喘各组细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表达量均明显高于空白组(P均<0.05)；宣肺平喘各组细胞中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表达量均明显低于香烟烟雾提取物组(P均<0.05)，且宣肺平喘高剂量组LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白及mRNA表达量均明显低于宣肺平喘低、中剂量组(P均<0.05)。见图5及图6。

图5 空白组和香烟烟雾提取物各组支气管上皮细胞自噬相关指标蛋白表达情况

图6 空白组和香烟烟雾提取物各组支气管上皮细胞自噬相关指标mRNA表达情况

3 讨 论

COPD是一种以进行性的气流受限和持续性的呼吸道症状为主的呼吸系统疾病，严重影响患者的生活质量[8]。细胞自噬是损坏的、衰老的细胞组织在溶酶体中降解的一种自噬途径[9]。自噬过程中产生氨基酸等各种细胞代谢所需的原料，是在特殊条件下维持细胞稳态的重要途径。近年来对于自噬与COPD的相关性研究增多。自噬是真核细胞对自身功能失调的组织进行的一种程序性死亡，自噬相关蛋白Beclin 1与凋亡相关蛋白Bcl-2或Bcl-XL 相互结合，导致Beclin 1形成吞噬泡，在LC3 Ⅰ/Ⅱ作用下延长包绕线粒体并发育成熟，然后与溶酶体结合，引发线粒体自噬，适当的自噬可以维持细胞功能的稳定，但过度的自噬会导致细胞功能失调[10-11]。p38是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的重要成员，参与了多种炎症细胞因子和应激信号的传导，在细胞分化、凋亡等过程中均有重要作用[12]。p38通路与细胞自噬调控显著相关，抑制p38磷酸化能显著降低细胞自噬水平[13]。

中医认为COPD主要是由于肺脾气虚、肾不纳气导致气机不利，痰阻气道，引起胸中憋闷胀满、气短等症状，属“喘证”“肺胀”范畴，治疗时发作期以化痰平喘为主，缓解期以补肺健脾益肾为法。宣肺平喘胶囊具有宣肺平喘、化痰止咳的作用，其适应证与COPD的主要病机相吻合。组方中炙麻黄的有效成分麻黄碱、伪麻黄碱通过阻止过敏介质的释放来发挥平喘作用；黄芩的有效成分黄芩素、黄芩苷等通过多种环节影响花生四烯酸代谢，不同程度地抑制前列腺素和白细胞三烯的生成，从而减轻炎性介质扩张血管、增加血管壁通透性及白细胞的趋化作用[14]。其他如桑白皮、葶苈子、苏子、紫菀均能够抑制炎症因子TNF-α、IL-8、IL-1β的释放，具有类似抗生素的作用[15-16]。前期临床研究证实，宣肺平喘胶囊可明显缓解COPD患者咳嗽、咳痰症状，改善肺功能，减少患者急性加重次数[17-18]。动物实验证实宣肺平喘胶囊可显著减轻COPD大鼠的气道炎症和气道组织结构改变，能降低血清中炎症因子表达[19-21]。

本实验研究发现，宣肺平喘胶囊可以不同程度阻碍细胞中自噬流，抑制自噬小体蓄积，还可以显著抑制p38磷酸化，同时减少Beclin 1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白及mRNA表达，因此推测宣肺平喘胶囊可以显著抑制香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞自噬，而这一作用可能与抑制p38 磷酸化密切相关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。