基于网络药理学探讨健脾养正消癥方治疗胃癌的作用机制

祁明浩，吴 坚，张 一，陈玉超

(南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

胃癌是严重威胁人类生命健康的重大疑难疾病，在我国胃癌的发病率位于全部恶性肿瘤的第2位，病死率位于全部恶性肿瘤的第3位[1]。我国尚没有开展胃癌的筛查工作，胃癌经常到晚期才得到诊断，而晚期胃癌患者的中位生存期仅为7～10个月[2]。手术是治疗胃癌最为有效也是目前为止唯一有可能治愈的手段，而晚期胃癌无法实施根治手术，多采用化疗、分子靶向治疗、对症支持、中医中药等姑息疗法。江苏省中医院2009年成为首批国家中医临床研究基地，在国内牵头开展了胃癌中医药治疗的循证医学研究。在晚期胃癌研究领域，由首届全国名中医刘沈林教授领衔，开展了“中医药对晚期胃癌生存期影响的干预方案及推广应用”(国家中医药行业科研专项，编号：201007007)，前期基于全国5个研究中心232例的队列研究结果表明：晚期胃癌患者在化疗的基础上服用健脾养正消癥方可以延长生存期，同时改善生活质量[3]，但健脾养正消癥方治疗胃癌的作用机制有待明确。网络药理学是近年来新兴的研究领域，为中药复方多成分、多靶点、多途径的特点提供了新的研究模式。笔者拟从网络药理学的角度探讨健脾养正消癥方治疗胃癌的主要有效成分和作用靶点，为进一步深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1健脾养正消癥方有效成分和靶点的获取 应用TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)。在“Herb name”中，分别检索健脾养正消癥方中的每味中药：党参、白术、茯苓、山药、薏苡仁、陈皮、木香、当归、白芍、菝葜、石见穿、甘草，并设置筛选条件为：生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18、半衰期(HL)≥4 h，从而获得这些中药的有效成分，合并去重。在“Related Targets”中(主要源自DrugBank数据库)获得上述有效成分的靶点。在Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)中查询上述靶点，获得对应的“Gene Name”。

1.2胃癌疾病靶点的获取 应用GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，在“disorders”中检索“gastric cancer”，获得相关靶点。在OMIM数据库(https://omim.org/)中检索“gastric cancer”，获得相关靶点。将这两个数据库获得的所有靶点合并去重。

1.3健脾养正消癥方和胃癌的共同靶点获取 使用R3.6.3软件获得两者靶点的交集，并绘制维恩图。

1.4构建健脾养正消癥方有效成分-靶点调控网络 使用Cytoscape3.8.0软件，根据健脾养正消癥方有效成分和胃癌的共同靶点绘制中药调控网络示意图。

1.5构建健脾养正消癥方蛋白互作网络 在String数据库(https://string-db.org/)中导入获得的共同靶点，绘制蛋白质相互作用关系(PPI)网络，根据数据库返回的结果，获得核心蛋白。

1.6GO功能富集和KEGG通路富集分析 使用R3.6.3软件，将Gene Name转换为Gene ID；进行GO(Gene Ontology，基因本体)功能富集分析，绘制柱状图；进行KEGG( Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，京都基因和基因组百科全书)通路富集分析，绘制气泡图。

2 结 果

2.1健脾养正消癥方的有效成分和靶点 健脾养正消癥方12味中药的有效成分，合并去重共152个。“有效成分-靶点”信息共1 917条，涉及靶点共276个。

2.2胃癌疾病靶点 在GeneCards数据库中检索到胃癌相关靶点1 825个，在OMIM数据库中检索到胃癌相关靶点170个，两者合并去重后共1 904个。

2.3健脾养正消癥方和胃癌疾病的共同靶点 两者共同靶点共135个(见图1)。

图1 健脾养正消癥方和胃癌的共同靶点维恩图

2.4健脾养正消癥方有效成分-靶点调控网络 如图2所示，蓝色的节点表示118个有效成分，绿色的节点表示135个靶点，紫色的边1 370条表示节点间的相关作用关系。根据有效成分的自由度大小，主要有效成分有槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷固醇(beta-sitosterol)、木犀草素(luteolin)、豆甾醇(Stigmasterol)、柚皮素(naringenin)等，见图3。

图2 健脾养正消癥方治疗胃癌的有效成分-靶点调控网络

图3 健脾养正消癥方治疗胃癌的主要有效成分

2.5健脾养正消癥方的蛋白互作网络 如图4所示，每个圆圈(节点)代表一个蛋白质，节点内的图案代表该蛋白的三维结构，节点间的连线代表蛋白间的相互作用关系，连线的颜色代表相关作用类型，连线的粗细代表相互作用强度。其中，核心调控蛋白有：AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3、MYC、EGFR、JUN、MAPK1、CCND1等，见图5。

图4 健脾养正消癥方治疗胃癌的蛋白质相互作用关系(PPI)网络

图5 健脾养正消癥方的核心调控蛋白

2.6GO功能富集和KEGG通路富集分析 如图6所示，GO功能富集主要有：泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)、激酶调节剂活性(kinase regulator activity)、磷酸酶结合(phosphatase binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)、DNA结合转录激活剂活性/RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)等。如图7所示，KEGG通路和本研究相关的富集主要有：PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、细胞衰老(Cellular senescence)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、铂类药物耐药(Platinum drug resistance)等。

图6 健脾养正消癥方治疗胃癌的GO功能富集分析

图7 健脾养正消癥方治疗胃癌的KEGG通路富集分析

3 讨 论

健脾养正消癥方是首届全国名中医、著名中医消化肿瘤专家刘沈林教授所创制，由古方资生丸化裁而成。刘教授指出，晚期胃癌的病机关键乃脾虚正衰、癌毒弥留。治疗上一是健脾养正，以滋养后天；一是化瘀消癥，以攻毒散结。方中党参、炒白术、茯苓、淮山药、生薏苡仁益气健脾渗湿；陈皮、木香理气和胃；当归、白芍养血和营；菝葜、石见穿解毒抗癌；炙甘草调和诸药。

该方药治疗胃癌共有118个有效成分，其主要成分有槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、木犀草素、豆甾醇、柚皮素、薯蓣皂苷元、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、川陈皮素、甘草查尔酮A等。槲皮素存在于甘草、石见穿中，通过阻断胃癌干细胞中的磷酸肌醇3激酶(PI3K)-Akt信号传导来触发线粒体凋亡依赖性生长抑制[4]；增强胃癌化疗药物伊立替康及其代谢产物 SN-38在人AGS细胞系中的功效[5]；通过调节Akt-mTOR信号和缺氧诱导的因子1α(HIF-1α)信号来激活自噬[6]。山柰酚存在于白芍、甘草中，通过IRE1-JNK-CHOP途径诱导自噬性细胞死亡并抑制胃癌细胞中的G9a[7]。β-谷固醇存在于当归、白芍、菝葜、石见穿中，在体外可显著抑制SGC-7901人胃癌细胞的生长并诱导其凋亡[8]。木犀草素存在于党参中，调节Notch1、PI3K、AKT、mTOR、ERK、STAT3和P38信号通路，并调节一系列miRNA的表达，而对胃癌细胞产生抗癌作用[9]；木犀草素通过抑制依赖于Notch1表达的血管内皮生长因子(VEGF)分泌来抑制胃癌的血管生成和拟态血管形成[10]；通过抑制Notch1信号传导和逆转上皮间质转化(EMT)来抑制胃癌进展[11]。豆甾醇存在于党参、山药、薏苡仁、木香、当归中，能诱导胃癌细胞凋亡，抑制JAK/STAT信号通路[12]。柚皮素存在于陈皮、甘草中，可抑制SGC-7901细胞的增殖，迁移和侵袭并诱导细胞凋亡[13]。

健脾养正消癥方治疗胃癌的核心调控蛋白有：AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3、MYC、EGFR、JUN、MAPK1、CCND1。AKT1编码一种活性激酶，有助于胃癌的进展，促进胃癌细胞增殖[14]。IL6编码一种细胞因子，在炎症和B细胞成熟中发挥作用；触发STAT3介导的miR-520d-5p抑制及其下游靶点CypB上调，调节胃癌细胞的生长和存活[15]。CASP3编码一种蛋白酶，在细胞凋亡的执行阶段起着核心作用，CASP家族可能成为胃癌的新预后指标，有助于治疗决策[16]。VEGFA编码一种生长因子，诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，以VEGFA为靶点的药物贝伐单抗已上市，AVAGAST研究表明：贝伐单抗联合化疗用于晚期胃癌的一线治疗可以改善无进展生存期和肿瘤缓解率[17]。

GO功能富集主要有：泛素样蛋白连接酶结合、激酶调节剂活性、磷酸酶结合、泛素蛋白连接酶结合、DNA结合转录激活剂活性/RNA聚合酶Ⅱ特异性等。KEGG通路和本研究相关的富集主要有：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶-B(PI3K-Akt)信号通路、细胞衰老、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、铂类药物耐药等。PI3K-Akt信号通路是最重要的细胞内通路之一，在胃癌等多种癌症中经常被激活，通过调节细胞增殖、分化、细胞代谢和细胞骨架重组，导致细胞凋亡和癌细胞存活[18]。除了已批准的依维莫司和替西罗莫司外，许多PI3K-Akt信号通路的靶向抑制剂正在临床研发中，如：斑蝥素通过CCAT1阻断PI3K/Akt信号传导通路来抑制胃癌细胞迁移和侵袭[19]，莲心碱通过ROS生成和PI3K-Akt途径抑制胃癌细胞的生长[20]，碘醚柳胺通过抑制PI3K/Akt/mTOR途径促进胃癌细胞凋亡和自噬[21]。细胞衰老被认为是有效的抗癌机制，是一种永久的、不可逆的细胞周期停滞状态，当细胞感受到各种压力时，包括端粒缩短、癌基因激活、肿瘤抑制剂失活和DNA损伤等，就会触发细胞衰老。如有研究表明[22]，BET抑制剂JQ1通过诱导细胞衰老来抑制胃癌细胞的增殖和侵袭性，BRD4通过E2F/miR-106b-5p/p21轴调节胃癌的细胞衰老。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法阐明了健脾养正消癥方治疗胃癌的主要有效成分为槲皮素、山柰酚、β-谷固醇、木犀草素、豆甾醇等，主要作用靶点为AKT1、IL6、CASP3、VEGFA、MAPK3等，通过PI3K-Akt信号通路、细胞衰老等途径发挥抗胃癌作用，充分体现了中药复方多成分、多靶点、多通路的调控机制，尽管网络药理学研究还存在一定的局限性[23]，但为健脾养正消癥方治疗胃癌的深入研究和开发奠定了基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。