组蛋白修饰影响肿瘤血管生成的研究进展

胡 昂，刘宇文，赖仲宏，张 弥，胡泽明，钟佳宁

（1. 赣南医学院2018级本科生；2. 赣南医学院2018级硕士研究生；3. 赣南医学院2017级本科生，江西 赣州 341000；4. 南京医科大学第一附属医院普外科，江苏 南京 210000；5. 赣南医学院心脑血管疾病防治教育部重点实验室，江西 赣州 341000）

肿瘤血管生成（Tumor angiogenesis）是肿瘤发生、发展、转移、复发过程中必不可缺的过程［1］。通过抑制血管新生治疗肿瘤，凭借治疗不良反应较小的优点，其很快便成为一种可供选择的临床肿瘤治疗方法，但目前对于肿瘤发生发展过程中血管新生的具体作用机制仍不清楚。因此，研究其所涉及的分子及其信号通路对临床上开发新的治疗策略具有重大意义。

表观遗传学（Epigenetics）是在基因核苷酸序列不发生改变的前提下研究可遗传基因表达调控方式的学科，包括DNA 甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA调控、染色质重塑等［2］。近些年研究发现，组蛋白修饰在表观遗传修饰中占据重要角色，并参与了多种疾病包括肿瘤的发生发展［3］。其中，血管生成与组蛋白修饰有着密切的联系，也是当前研究的热点和难点。因此本文就组蛋白修饰影响肿瘤血管生成的研究现状作一系统阐述。

1 组蛋白修饰

1.1 组蛋白与组蛋白修饰概述 组蛋白是染色体的结构蛋白，由H1、H2A、H2B、H3及H4组成。其与DNA 形成染色质的基本结构单位核小体，每个核小体由146 对碱基围绕组蛋白八聚体构成，组蛋白八聚体由4 种组蛋白H2A、H2B、H3、H4 各两个分子组成。核小体通过核心颗粒之间的连接DNA 相互串联并进一步折叠形成染色质纤维，组蛋白修饰的过程主要发生在赖氨酸和精氨酸两个修饰位点。组蛋白修饰是指组蛋白在相关酶的作用下发生乙酰化/去乙酰化、甲基化/去甲基化、泛素化、磷酸化、SUMO 化、生物素化等修饰的动态变化过程，目前，研究较多的是组蛋白的甲基化与乙酰化。组蛋白修饰一般需要3种成分参与：组蛋白修饰酶、组蛋白去修饰酶、效应分子，组蛋白修饰酶和去修饰酶的作用是催化或去除蛋白特定位点上的修饰基团，而效应分子的作用是通过自身某些结构域特异性识别相应的组蛋白修饰基团并与其下游分子结合发挥作用。此类效应分子主要指MSK1/2、p300、PRMT和hMOF 等，而其中起到特异识别作用的结构域主要包括Chromo Domain、Tudor Domain、MBT Domain、PHD Domain、WDR40 Repeats、Ankyrin Repeats 等［4］（表1）。组蛋白修饰在特定的细胞周期中在特定的组蛋白位点上发挥作用，并发生相应的翻译后修饰从而可以在不同条件下改变染色质的结构和功能。研究至今，已经发现组蛋白修饰在肿瘤、慢性肾病、动脉粥样硬化、神经系统疾病、内分泌疾病、炎性病变等多种疾病或病理过程中发挥着重要的作用［5］。

表1 常见的组蛋白修饰类型、位点及其效应分子

1.2 组蛋白乙酰化与去乙酰化 乙酰化是第一种被发现的组蛋白翻译后修饰。该过程主要由组蛋白乙酰化酶（Histone acetylases，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases，HDACs）催化完成。乙酰化主要发生在组蛋白H3 和H4 的赖氨酸残基上。HATs 通过在氨基酸残基的ε-氨基基团上引入疏水的乙酰基部分，使氨基上的正电荷被抵消，导致DNA 与组蛋白间的空间位阻增大，造成两者间的相互作用减弱。核小体的结构变得松弛，染色质处于转录活性状态，有利于转录因子与DNA 分子相结合，进而激活基因转录。HDACs 则移去组蛋白氨基酸残基上的乙酰基，带正电的氨基酸残基与DNA 分子的电性相反，因此组蛋白和DNA 稳定结合，染色质呈紧密卷曲的结构从而抑制基因转录。组蛋白乙酰化除了调控基因转录外，还被发现参与调节血管生成、细胞周期、复制、DNA 修复、DNA 应激反应、凋亡、自噬等基本细胞过程［6-8］。

1.3 组蛋白甲基化与去甲基化 组蛋白甲基化是一种比组蛋白乙酰化更为复杂的翻译后组蛋白修饰方式。甲基化主要发生在组蛋白H3和H4的赖氨酸或精氨酸残基上，组蛋白甲基化主要由组蛋白甲基化酶（Histone methyltransferases，HMTs）和组蛋白去甲基化酶（Histone demethylase，HDMs）催化完成（图1）。目前，一般将组蛋白甲基化归类为组蛋白赖氨酸残基的单甲基化、双甲基化或三甲基化，精氨酸残基的单甲基化、双甲基化和非对称双甲基化。在组蛋白的残基上添加甲基对基因表达的影响取决于其添加的残基位点和添加的基团数量，如组蛋白H3K4 的二甲基化、三甲基化（H3K4me2、H3K4me3）以及H3K36 的三甲基化（H3K36me3）与下游基因的转录激活有关，而H3K36 的二甲基化（H3K36me2）、H3K27 的三甲基化（H3K27me3）与基因沉默有关［9-10］。组蛋白甲基化除了调控基因转录外，还被发现参与调节基因组的完整性、X染色体失活、异染色质形成以及细胞发育等过程［11］。

图1 组蛋白乙酰化、甲基化和磷酸化修饰示意图（以赖氨酸和苏氨酸为例）

2 血管生成

2.1 血管生成概述 血管生成一般包括血管形成（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）两种方式，前者是通过血管母细胞分裂增殖形成完整的血管系统，而后者是指活体组织在已存在的微血管集合域上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。血管生成过程受到许多内源性诱导因子影响，这些因子通常与其抑制因子如血小板反应素（Thrombospondins）、血管抑素（Angiostatin）、内皮抑素（Endostatin）等保持平衡。当机体内这种平衡被打破时，就可能会促进或抑制血管生成。血管生成常见于伤口愈合、损伤修复、肿瘤生长和转移等过程，而在成年个体正常情况下比较少见，仅见于卵巢黄体血管的周期性生长以及怀孕期间的血管生成。

2.2 肿瘤血管生成 肿瘤血管生成是肿瘤发生、发展、转移、复发过程中最基本的因素之一。在肿瘤中血管主要生成方式为血管新生（Angiogenesis）即原有血管出芽。肿瘤血管生成很大程度上影响着肿瘤的发展，一般认为肿瘤直径达到1～2 mm后，若无新生血管生成提供营养将不能继续生长［12］。肿瘤血管生成有许多关键的步骤，主要包括肿瘤细胞和炎症细胞（主要为巨噬细胞）分泌大量促血管生成因子、细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的局部降解产生细胞间隙、内皮细胞的迁移与增殖、管腔的形成与成熟，最终导致新生的肿瘤血管形成。与正常血管相比，肿瘤血管是杂乱无章的，不具有从小动脉到毛细血管再到小静脉的正常层次结构，且内皮细胞不与壁细胞直接接触，而是与基底膜松散连接，所以肿瘤血管更容易发生渗漏。肿瘤血管生成的每一步都会受到各种细胞信号、细胞因子的影响，如缺氧诱导因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血 管 内 皮 生 长 因 子（Vascular endothelial growth factor，VEGFs）、成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF）、基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和血小板衍生生 长 因 子（Platelet-derived growth factors，PDGF）等［13］。在快速生长的肿瘤中，肿瘤血管生成的进程在上述影响因子的作用下触发，导致正常静止的内皮细胞增殖和萌发。有研究报道，肿瘤血管生成还存在一种称为“血管生成拟态”的现象，它通过肿瘤细胞自身的分裂增殖生成类似血管的管状结构直接与血管相通，不再依赖血管生成而通过该种特殊结构直接参与肿瘤微循环过程［14］。近些年，抑制肿瘤血管生成一直是热门的研究方向之一，这种通过切断肿瘤细胞增殖的营养供应来治疗肿瘤的方法可以很大程度减小药物对人体正常组织的毒副作用。贝伐单抗（Avastin）是一种人源化的抗VEGF-A单克隆抗体，也是第一种应用于临床以血管新生为靶点的药物，现已被用于治疗乳腺癌、结直肠癌、肺癌等恶性肿瘤，但这种方法的疗效仍存在一定的争议［15］。此外，还有一些基于血管新生的药物如血管抑素和内皮抑素等也已经通过临床试验并投入使用。

3 组蛋白修饰与肿瘤血管生成

3.1 组蛋白乙酰化与肿瘤血管生成 近年研究提示，组蛋白乙酰化和去乙酰化可能通过两种作用机制影响肿瘤血管生成，一种是肿瘤细胞的过度增殖导致肿瘤微环境低氧，低氧环境诱导某些去乙酰化酶（HDAC1、HDAC2、HDAC3）在肿瘤细胞中表达增加，进而导致VHL 蛋白的表达减少［16］。VHL 蛋白可以通过双加氧酶识别HIF-1A 并使其泛素化，从而使HIF-1A 被蛋白酶体识别并降解。因此，VHL蛋白表达下调会导致特异转录因子HIF-1A 表达增加［17-18］。随后，HIF-1A 转移到细胞核内与增强子等远端调控序列和HIF-1B 结合形成复合物，之后与缺氧反应元件（Hypoxia responsive element，HREs）结合，启动VEGF 等相关基因的转录从而促进血管新生［19-20］。TUDISCO L 等［21］通过诱导低氧环境下培养的内皮细胞胎盘生长因子（Placenta growth factor，PlGF）的表达，发现PlGF 的内含子中组蛋白H3 和H4 呈高乙酰化状态，表明HIF-1A 通过HREs位点的染色质重塑直接参与缺氧条件下PlGF 表达的上调。与其类似的是，乙酰基转移酶p300 在低氧下可以通过HIF-1A 与血管内皮生长因子启动子中的HREs 结合，从而上调VEGF 的转录水平［22］。

相关研究［23-24］报道了另一种机制，热休克蛋白（Heat shock protein，HSP）通过与HIF-A 相互作用进而影响肿瘤血管生成。热休克蛋白90（HSP90）作为一种分子伴侣蛋白可以协助某些蛋白质正确折叠或与其形成复合物并增强稳定性，此类蛋白包括Akt、Raf、Her-2、HIF-A 及p53［25］。HIF-A 和HSP90 结合后将使复合物趋于稳定，但是，受相关组蛋白乙酰化的影响，HSP90 的稳定作用将会大大降低并促使HIF-A 被蛋白酶体降解［26］。进而，HIF-A 的减少代偿性地造成HSP90 表达增多，导致侵袭相关蛋白MMP-2和VEGF 表达降低从而也抑制了肿瘤血管生成［27］。此外，热休克蛋白60（HSP60）也在肿瘤血管生成过程中发挥一定的作用。有研究表明，幽门螺旋杆菌源性的HSP60 可以促进细胞迁移与血管结构的形成从而促进胃癌的血管新生进程［28］。可见组蛋白去乙酰化是肿瘤发生发展过程中的一个重要影响因素，因此，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（His‐tone deacetylase inhibitor，HDACi）也随之成为临床上一种新的肿瘤治疗手段［29］。HDACi 一般会使启动子区域染色质内组蛋白H3 的乙酰化程度明显升高，还会使VEGF 及VEGFR 的蛋白表达水平明显降低［30］。HIF-A 在正常氧浓度下是不稳定的，而目前认为，Ⅱ类HDAC 如HDAC4［31］、HDAC6［32］可以通过介导氨基末端去乙酰化修饰来增强HIF-A 的稳定性。因此Ⅱ类HDAC 的特异抑制剂如TSA、LAQ824、PXD101、LBH589 和SAHA 等可以直接影响HIF-A 的转录活性和功能从而调节肿瘤血管生成［33］。HDACi 的作用也在一定程度上佐证了组蛋白乙酰化在肿瘤血管生成和内皮细胞增殖中所起的作用。

3.2 组蛋白甲基化与肿瘤血管生成 组蛋白甲基化可以影响染色质转录区的开放状态、染色体的失活状态和DNA 修复，相关下游基因的表达与组蛋白甲基化有关，并且组蛋白甲基化参与包括血管生成等多种代谢过程。EZH2 一种可以介导H3K27me3修饰组蛋白甲基转移酶［34］。已有研究表明，EZH2参与了正常的血管生成，DREGER H 等［35］发现当沉默EZH2 后人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）毛细血管形成和细胞黏附、迁移等受到抑制。其次，多项研究也发现，EZH2也参与了肿瘤血管生成的相关过程。CREA F等［36］研究发现，在肿瘤细胞中EZH2 介导了抗肿瘤转移相关基因和基质金属蛋白酶抑制剂的沉默。RICHTER G H 等［37］观察到EZH2 促进肿瘤血管生成并且参与了肿瘤干细胞（Cancer stem cell，CSC）向血管内皮细胞的转化。NAKAGAWA S 等［38］运用生物信息学分析发现EZH2 与肿瘤血管生成具有相关性，且采取胆管癌患者样本进一步分析EZH2和VASH1表达的相关性，发现EZH2 的高表达与肿瘤血管生成的激活有关，并且其介导的血管新生通路的激活可以用来预测胆管癌患者的预后。

G9a 作为一种组蛋白甲基转移酶，参与了H3K27me 和H3K9me 的修饰［39］。普遍认为，G9a 在肿瘤细胞增殖和肿瘤血管生成中都发挥着必不可缺的作用［40］。在一项关于宫颈癌的研究中用G9a组蛋白甲基转移酶（Histone methyltransferase，HMT）抑制剂处理SiHA 细胞发现，某些血管生成因子如VEGF、IL-8 和血管生成素等的表达均被明显抑制，而且用该抑制剂配制的条件培养液抑制了内皮细胞的增殖、迁移［41］。与组蛋白乙酰化相似的是，G9a甲基化影响肿瘤血管生成也与HIF-1A有关。有研究报道，HIF-1A蛋白的稳定性和功能受到甲基化的影响，特异性抑制G9a 后不仅导致VEGFA 和HIF-1A的表达下调，而且可以加速蛋白酶体对HIF-1A的降解。而且，使用G9a 抑制剂还能抑制HUVECs 中MMP2和FAK的活性进而影响血管新生过程中的基质降解［42］。以上结果表明，G9a 可能在一定程度上参与了肿瘤发生发展过程中的血管新生。有趣的是，还有报道称G9a调控VEGFA mRNA 前体的可变剪接，但这种选择性剪接并不改变总的VEGFA mRNA 水平［43］。此外，还有一些组蛋白甲基化酶如DOT1L、SMYD3 和组蛋白去甲基化酶如LSD1 均与肿瘤血管生成有关。组蛋白甲基化酶DOT1L 敲除导致细胞存活率、迁移、血管形成、毛细血管发芽减少，并抑制体内功能性血管网络的形成，而且DOT1L 可以与转录因子Ets-1 协同调节VEGFR2（VEGF receptor 2）的表达［44］。关于组蛋白甲基化酶SMYD3，其在结直肠癌、肝细胞癌和乳腺癌中的表达水平升高。并且，SMYD3 可以甲基化VEGFR1 第831 位赖氨酸残基，甲基化的VEGFR1 可以增加其在细胞中的激酶活性［45］。组蛋白去甲基化酶LSD1使HIF-1A 在第391 位赖氨酸残基去甲基化，以保护HIF-1A 免受泛素介导的蛋白质降解，LSD1 稳定的HIF-1A 与CBP 和MTA1 协同作用可以增强VEGFA诱导的肿瘤血管生成［46］。在前列腺癌中，LSD1的高表达与肿瘤复发和VEGFA的表达增加相关，沉默前列腺癌细胞中LSD1 的表达可以降低VEGFA 的表达［47］。

3.3 其他组蛋白修饰与肿瘤血管生成 有研究显示，EYA 蛋白介导的组蛋白H2AX 第142 位酪氨酸（Tyrosine）的去磷酸化修饰可以促进细胞迁移、血管生成和转移［48］。WANG Y等［49］发现内皮细胞中EYA3的缺失显著减少了异种移植瘤的肿瘤血管生成，限制了肿瘤生长。然而，肿瘤细胞中EYA3 缺失虽然降低了肿瘤细胞增殖和肿瘤生长，但是该缺失并不影响肿瘤的血管生成。这就提示EYA3 可能通过内皮细胞某种自主作用机制调控肿瘤血管生成。相关研究报道，作为一种进化保守的多梳蛋白（Polycomb proteins，PcGs），Yin Yang 1（YY1）通过调控细胞周期参与了数种实体和血液肿瘤发生和转移，沉默YY1 可以在一定程度上减少肿瘤的血管生成［50-51］。INFANTE T等［52］对YY1 进一步研究发现，YY1 可能参与了缺氧环境下的组蛋白修饰。在低氧环境下，VEGFA 的非翻译区末端组蛋白泛素化修饰加强。因此，YY1 介导的肿瘤血管生成可能与VEGFA 非翻译区的组蛋白泛素化修饰有关。组蛋白SUMO化可以拮抗赖氨酸侧链上的乙酰化修饰和泛素化修饰，SUMO 化通常被认为起到转录抑制作用［53-54］，因此，SUMO 化可能通过影响其他组蛋白修饰而影响肿瘤血管生成。组蛋白修饰中单独一种修饰类型往往不能发挥效应，修饰过程中存在着特殊的修饰级联效应，即某种先发生的修饰可以促进或抑制之后发生的相关修饰，表现为某种修饰为另一种修饰发生所必需的前提［4］。如LEE J S 等［55］的研究发现，组蛋白H2B 泛素化修饰是H3K4 发生甲基化的前提。组蛋白修饰级联效应的存在提示我们上游修饰可能通过影响下游修饰从而影响最终的生物学效应。研究表明，H3K4 的三甲基化等修饰增加导致VASH2在肝癌细胞中异常表达，VASH2通过SVBP 介导的旁分泌机制参与和促进肝癌的血管生成［56］。该项研究中H3K4 的三甲基化的上游修饰可能就包括了uH2B修饰并受其影响，所以某些组蛋白修饰可能通过其下游修饰间接参与调控过程。

4 总结与展望

肿瘤血管生成是在肿瘤发生、发展、转移、复发过程中至关重要的一个环节，该过程受到DNA 甲基化、组蛋白修饰等多种因素的调控。已有研究证明，最为广泛修饰的组蛋白乙酰化和甲基化与肿瘤血管生成密切相关，组蛋白修饰酶和去修饰酶在这一过程中发挥重要作用。其可以通过作用于癌基因、改变自身表达量、与热休克蛋白相互作用等方式调节该生物学过程。因此，组蛋白修饰酶抑制剂被认为是一种具有抗肿瘤血管生成潜力的药物，并可能将成为一种新型的肿瘤治疗方式，相关抑制剂在作用过程中对肿瘤组织的特异性识别是目前亟待解决的问题。总之，通过研究肿瘤细胞或者相关肿瘤血管中的表观遗传学改变，很可能在不久的将来为治疗某些癌症提供新方法和新思路。