聚乙二醇修饰的四氧化三锰纳米粒子对软骨细胞炎症模型的影响*

张盛清，蔡金宏，黄兰丽，高 明△，赵劲民,4,5△

（1.广西组织器官修复医用生物材料工程技术研究中心；2.广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心；3.广西医科大学药学院；4.广西再生医学重点实验室；5.广西医科大学第一附属医院创伤骨科手外科，南宁 530021）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以疼痛、软骨缺损和关节炎症为特征的慢性疾病，目前临床上的治疗方式十分有限[1]。目前有一种观点认为，活性氧（reactive oxygen species，ROS）作为一种参与细胞内信号传导的重要物质[2-4]，在调节软骨细胞衰老、凋亡、细胞外基质合成和降解的同时，也在骨关节炎的进展中产生了重要的影响[5]。当ROS浓度超过了机体的抗氧化能力时，将产生大量的氧化中间产物，进而导致软骨细胞DNA 损伤，干扰和抑制软骨基质合成并激活基质金属蛋白酶，造成软骨细胞死亡加快OA 的进程。所以，清除致损氧化中间产物，减缓氧化应激效应，被认为是治疗OA的可行方案。四氧化三锰纳米粒子（Mn3O4NPs）是目前倍受众关注的一种纳米酶材料，由于有着Mn2+/Mn3+的混合氧化状态、高不可逆氧化稳定性、大比表面积等特点，使Mn3O4NPs具有了显著的多重拟酶活性[6-7]。本研究将通过表面修饰加强Mn3O4NPs的生物相容性，并探讨修饰后的Mn3O4NPs 通过清除ROS 对OA的抗炎抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 动物 SD 大鼠（SPF 级），体重（180±2）g，广西医科大学实验动物中心提供，本实验已通过实验动物伦理审批，审批编号No.202010023。

1.1.2 试剂 四水合醋酸锰[Mn(CH3COO)2·4H2O]（aladdin，上海）；水合肼（N2H4）（aladdin，上海）；无水乙醇（sinopharm，上海）；无水甲醇（sinopharm，上海）；聚乙二醇（PEG Mn=3 350）（sigma-aldrich，美国）；过氧化氢（H2O2）（JINSHAN，成都）；CCK-8 检测试剂盒（sigma-aldrich，美国）；钙黄绿素（Calcein-AM）（sigma-aldrich，美国）；碘化丙啶（PI）（sigma-aldrich，美国）；超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（sigma-aldrich，美国）；过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（beyotime，上海）；羟自由基（·OH）检测试剂盒（solarbio，北京）；组织细胞RNA 小量提取试剂盒（magen，广州）；胎牛血清（every green，浙江）；高糖培养基（gibco，美国）。

1.1.3 仪器与设备 透射电子显微镜（TEM）（HITACHI，日本）、X射线衍射仪（XRD）（Rigaku，日本）；傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）（SHIMADZU，日本）；纳米粒度及ZETA 电位分析仪（Malvern，英国）；全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国）；PCR 仪（Roche，瑞士）；荧光成像显微镜（OLYMPUS，日本）；超纯水机（Merck，德国）；5810R 低温高速离心机（Eppendorf，德国）；电热真空干燥箱（博讯实业，上海）。

1.2 材料合成

1.2.1 Mn3O4NPs的合成

在已有文献[8]的技术上进行改进，在室温条件下合成了Mn3O4NPs。首先称取400 mgMn(CH3COO)2·4H2O置于圆底烧瓶内，加入60 mL 超纯水充分溶解并保持搅拌。向搅拌的液体中快速加入1 mL N2H4，保持搅拌。反应24 h后将溶液转移至洁净的50 mL离心管内，离心10 min 去除上清液，用无水甲醇重复洗涤沉淀3次，重悬沉淀后再次离心，去除上清液后得到深褐色沉淀，将深褐色沉淀65°C真空干燥12 h。干燥所得褐色固体即为Mn3O4NPs。

1.2.2 聚乙二醇修饰的四氧化三锰纳米粒子（Mn3O4-PEG NPs）的合成 称取MPEG=5%MMn的PEG，充分溶解于无水乙醇中并加入充分分散的Mn3O4NPs，保持搅拌。反应24 h 后将溶液转移至洁净的50 mL 离心管内，高速离心10 min 去除上清液，用无水甲醇重复洗涤沉淀3次，重悬沉淀后再次离心，去除上清液后得到深褐色沉淀，将沉淀65°C真空干燥12 h。干燥所得褐色固体即为Mn3O4-PEG NPs。

1.3 材料表征

将上述真空干燥所得材料，取少量粉末分别用于TEM、XRD、FTIR和ZETA电位测量。

1.4 Mn3O4-PEG NPs 的拟SOD 酶活性、拟CAT 酶活性和羟自由基（·OH）清除率测量

根据试剂盒说明书，计算好样品分组及试剂用量，分别配制适量的工作液和样本溶液。对于拟SOD酶活性测量，根据超氧阴离子氧化WST-8显色的原理，通过计算不同样品450 nm 处的吸光值，即可得知不同样本中的超氧阴离子（·O2-）清除率；对于拟CAT酶活性测量，根据H2O2氧化显色底物显色的原理，通过计算不同样品520 nm 处的吸光值，即可得知不同样本中的H2O2清除率；对于·OH清除率测量，根据·OH 可与显色剂反应显色的原理，通过计算不同样品536 nm处的吸光值，即可得知不同样本中的·OH清除率。

1.5 软骨细胞的原代培养

软骨组织取自3～5 日龄SD 乳鼠的关节部分，并用含10%青链霉素双抗的PBS 冲去凝血和杂质。组织块置于洁净的培养皿中，先用胰酶在37°C下消化2 h，之后离心去除上清液收集沉淀，收集到的沉淀用Ⅱ型胶原酶重悬，并在37°C 培养箱中消化过夜。次日，差速离心去除消化剥离的纤维后，离心收集游离出的软骨细胞。将已收集好的软骨细胞重悬后接种于培养皿中，待细胞贴壁后传代培养，传至P2～P3代使用。

1.6 生物相容性检测

CCK-8法：将约8×103个/孔P2～P3代软骨细胞接种于96 孔板内，培养细胞24 h 后，分别更换用无血清培养基配制的不同浓度的材料溶液。继续培养细胞24 h后先吸去孔内液体，并用生理盐水冲洗两边去除残余材料。随后加入按1∶10 比例配制好的CCK-8 工作液110 μL，继续孵育1 h。因CCK-8工作液会与孔内活细胞产生橙黄色甲臜物，测量各孔内液体在450 nm 处的吸光值即可得知各实验组细胞存活量。

细胞活死染色法：将约2×105个/孔P2～P3代软骨细胞接种于放置有爬片的6 孔板内，培养细胞24 h 后，分别更换用无血清培养基配制的不同浓度的材料溶液。继续培养细胞24 h 后，先吸去孔内液体，并用生理盐水冲洗两边去除残余材料。用配制好的Calcein-AM/PI染色工作液浸没过爬片，避光染色10 min，随后用生理盐水冲洗3 次去多余染料。完成爬片染色后，将爬片置于荧光成像显微镜下，随机选取3个视野观察和拍照记录。

1.7 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测

将约3×105个/孔P2～P3代软细胞接种于6孔板内。当细胞完全贴壁后，吸除孔内液体，并用生理盐水冲洗两边除去杂质和未贴壁细胞。随后加入用无血清培养基配制的浓度为200 μmol/L 的H2O2诱导细胞进入氧化应激状态。待诱导细胞完成后，再加更换有不同材料的无血清培养基，继续培养细胞 24 h。次日吸除孔内液体，并用生理盐水冲洗两边去除残余的材料，随后按照试剂盒说明书提取各实验组mRNA 样本，保存于-80°C 冰箱中，以备用于RT-qPCR实验。RT-qPCR所用引物序列，见表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.8 统计学方法

采用SPSS 26.0统计软件对相关实验数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间均数对比采用t检验；多组间均数对比采用One-way anova，组间两两比较采用LSD-t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TEM检查结果

TEM 显示，合成的Mn3O4-PEG NPs 呈方台状，粒子分散性良好，见图1。

图1 Mn3O4-PEG NPs透射电镜图

2.2 XRD表征结果

XRD 图谱显示，所合成的Mn3O4NPs 主峰未出现较大偏移，在2θ=18.2°、26.3°、29.0°、31.1°、32.5°、36.2°、38.2°、44.6°、50.8°和60.0°处分别出现了与标准Mn3O4卡片（JCPDS24-0734）对应的强衍射峰，由此可认为Mn3O4NPs已成功合成。PEG修饰后所得的Mn3O4-PEG NPs 也含有相同的衍射峰，峰强比和半峰宽没有出现明显改变，说明修饰过程对Mn3O4NPs 的微观结构没有造成明显影响，基本保持了Mn3O4NPs原本的结晶度，见图2A。

2.3 FTIR表征结果

FTIR 结果显示，相比于修饰前，修饰后的Mn3O4-PEG NPs 含有与对照PEG 样品相同的红外吸收峰峰，证明PEG已成功修饰到Mn3O4NPs表面，见图2B。

图2 XRD和FTIR表征结果

2.4 Mn3O4 NPs 和Mn3O4-PEG NPs 的ZETA 电位测量结果

修饰后Mn3O4NPs 表面的ZETA 电位发生了明显的改变，由-18.27 mV转变为-8.74 mV，这是由于PEG 的链状分子包覆于Mn3O4NPs 外表，屏蔽了粒子部分表面电荷所致，证明PEG 成功修饰到了Mn3O4NPs的表面，见图3。

图3 Mn3O4 NPs和Mn3O4-PEG NPs的ZETA电位测量结果

2.5 Mn3O4-PEG NPs的生物相容性评价

2.5.1 不同浓度Mn3O4NPs组和Mn3O4-PEG NPs组干预24 h 对软骨细胞活性的影响 当Mn3O4-PEG NPs浓度约在20 μg/mL以内时，实验组软骨细胞活性与空白对照组比较，可以保持在80%以上，对比未经修饰的Mn3O4NPs，在浓度约10 μg/mL 时就已经产生一定毒性，经过修饰的Mn3O4-PEG NPs明显有着更好的生物相容性，见图4。

图4 不同浓度Mn3O4 NPs组和Mn3O4-PEG NPs组干预24 h对软骨细胞活性的影响

2.5.2 Mn3O4NPs 组和Mn3O4-PEG NPs 组的Calcien-AM/PI 染色和荧光定量分析 当共培养浓度为20 μg/mL时，Mn3O4-PEG NPs对软骨细胞基本没有表现出毒性作用，与Mn3O4NPs组比较差异有统计学意义（P＜0.01），见图5。

图5 Mn3O4 NPs组与Mn3O4-PEG NPs组的Calcien-AM/PI染色和荧光定量分析

2.6 Mn3O4-PEG NPs的ROS清除作用

伴随着浓度的升高，Mn3O4-PEG NPs 的拟SOD酶活性也逐渐升高，且与Mn3O4NPs的拟SOD酶活性无显著区别，见图6A。在清除H2O2和·OH 两种活性氧基团时也表现出了较强的活性，且与Mn3O4NPs的清除能力比较差异有统计学意义，见图6B。证明PEG 修饰在提高Mn3O4-PEG NPs 分散性和生物相容性的同时，未显著影响Mn3O4NPs的拟酶活性。

图6 Mn3O4 NPs与Mn3O4-PEG NPs的·O2-、H2O2、·OH清除率对比

2.7 Mn3O4-PEG NPs 对H2O2诱导的软骨细胞模型中TNF-α、IL-1β和IL-6表达的影响

按最大生物相容剂量，Mn3O4-PEG NPs对TNFα、IL-1β和IL-6 3种炎症因子的表达均下调，且结果与H2O2组比较差异具有统计学意义（P＜0.01），见图7。

图7 Mn3O4-PEG NPs对H2O2诱导的软骨细胞模型中TNF-α、IL-1β、IL-6表达的影响

3 讨论

目前，国内有着大量的患者长期遭受着OA 的折磨[9]，患者在遭受着强烈疼痛的同时，也面临着极高的致残风险，这无疑会对患者及其家庭造成沉重的打击。目前关于OA 的发病机制尚无统一的结论，多数研究认为OA 的发病可能由多种因素综合引发（如年龄、劳损、内分泌等）。近些年也有研究指出，诸如·O2-、H2O2和·OH等氧化中间产物会导致细胞损伤，引起的细胞内氧化和抗氧化统失衡，是诱发OA 的重要原因之一。因此，控制组织内ROS含量，维持细胞内氧化/抗氧化平衡是治疗OA 的一个重要潜在途径。

尽管生物体内已在自然进化中形成了高效的天然活性氧清除酶，但因其是有机质且对反应环境具有高敏感性（如温度和pH 稳定性），条件不当时极易失活，难以大量生产、保存和利用。不同于天然酶，人工纳米酶有着更好的稳定性，易生产性，且兼具多功能性和可调谐活性，因而目前受到人们广泛的关注，目前的研究报道中已经发现了不少性能优异的抗ROS纳米酶[10-11]。而另一方面，Mn超氧化物歧化酶（SOD）的模拟作用也在药代动力学研究中被发现，据报道其催化性能是优于Cu/Zn SOD和Fe SOD 的[12]。因此，由于Mn3O4NPs 有着显著的多重拟酶活性，是目前纳米酶研究的热点之一。在本研究中，所合成的Mn3O4-PEG NPs 电镜下呈现为大小均匀的方台状颗粒，粒径约为100 nm，分散性良好。XRD、FTIR 和ZETA 电位结果表明，粒子表面成功的修饰有PEG分子，且当浓度在20 μg/mL浓度以下时，Mn3O4-PEG NPs 没有表现出明显细胞毒性。综上所述，Mn3O4-PEG NPs 被成功合成且具有较好的生物相容性。

OA 造成的损伤以软骨缺损为主，包括·O2-、H2O2和·OH 等氧化中间产物在内的ROS 基团与骨关节疾病的进展呈显著相关[5]。本研究进一步验证了Mn3O4-PEG NPs对ROS的催化清除能力，结果显示，Mn3O4-PEG NPs 在清除·O2-、H2O2和·OH 3 种活性氧基团时均表现出了较高活性，且与Mn3O4NPs的·O2-、H2O2和·OH清除能力相比无统计学差异，证明修饰过程在提高Mn3O4-PEG NPs 分散性和生物相容性的同时，未影响Mn3O4-PEG NPs 发挥其拟酶活性。结果表明，Mn3O4-PEG NPs 具有作为关节腔内清除ROS的纳米酶的潜力。

由于ROS是调控炎症的重要信号分子，ROS的失衡是引起关节炎症因子表达上调，造成关节软骨损伤的重要原因之一。而早先的研究中尽管存在一些分歧，但TNF-α、IL-1β 普遍被认为是与关节炎早期发病及关节炎早、晚期病程密切相关的[13]。在本研究中，浓度为20 μg/mL的Mn3O4-PEG NPs成功下调了TNF-α、IL-1β 和IL-6 3 种炎症因子的表达，且结果具有统计学差异，证明适量的Mn3O4-PEG NPs具有作为关节腔内抗炎药物的潜力。

综上所述，本研究成功制备了一种具有良好分散性和多重拟酶活性的抗ROS纳米酶，在体外实验中能有效清除·O2-、H2O2和·OH 3种活性氧基团，且细胞实验证明，所合成的纳米酶生物相容性良好，能够下调氧化应激状态下的软骨细胞中炎症因子的表达。在未来的实验中，我们将在保证安全性的前提下，进一步验证Mn3O4-PEG NPs 在动物体内能否达到治疗关节炎的效果，以便对Mn3O4-PEG NPs作为纳米酶的功效进行更全面的评价，为其清除ROS 维持组织氧化/抗氧化平衡治疗OA 提供更详实的理论和实验数据支持。