山枝子茎叶提取物对小鼠急性肝损伤的保护作用研究*

韦莎莎，戴国满，张晓萍，黄仁彬△

（1.广西壮族自治区妇幼保健院，南宁 530003；2.广西壮族自治区人民医院，南宁 530021；3.广西医科大学药学院，南宁 530021）

山枝子茎和叶（SZZJY）为茜草科植物栀子Gardenia Jasminoides Ellis的茎和叶，常生于低山温暖的疏林或荒坡中，主要分布于长江以南地区。研究发现，栀子果实主要含有环烯醚萜类、二萜类及有机酸酯类等成分[1-3]，具有保肝、利胆、抗炎、镇痛及抗氧化等活性[4-6]，栀子叶化学成分中也发现含有栀子苷、京尼平苷等环烯醚萜类[7]。本课题前期研究表明，山枝子根水提物对大鼠肝纤维化有保护作用[8]。本研究旨在对SZZJY水提物进行临床前药效学研究，探究其对四氯化碳（CCl4）和D-氨基半乳糖（D-Gal）所致急性化学性肝损伤小鼠的保护作用及其可能机制，为山枝子非传统药用部位得到充分利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF 级昆明种小鼠60 只，雄性，体重18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（桂）2014-0002，动物使用许可证号：SYXK（桂）2014-0003。

1.2 药物 SZZJY采摘于广西灵山县，经过广西中医药研究所赖茂祥教授鉴定。将SZZJY晒干后，依次加入12 倍、10 倍、8 倍量蒸馏水煎煮3 次，收集合并3次提取液，过滤后用减压浓缩至0.125 g药液约含1 g生药。

1.3 主要试剂 CCl4，成都市科龙化工试剂厂，批号：2014 061301；D-Gal，Scientific Research Special，批号：G0500；联苯双酯滴丸，北京协和药厂，批号：15 050207；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、蛋白定量试剂盒（BCA）均购于南京建成生物工程研究所；增殖细胞核抗原（PCNA）、BOSTTER（批号：BM0104）、Bax（批号：NBP2-29468）、Bcl-2（批号：bs-0032R）均购于北京博奥森生物有限公司。

1.4 动物分组及肝损伤模型的建立 所有小鼠适应性喂养3 d后，随机分为6组，即正常对照组、CCl4/D-Gal 模型组、联苯双酯组（150 mg/kg）及SZZJYE高、中、低剂量组（5.00 g/kg、2.50 g/kg、1.25 g/kg），每组10 只。SZZJYE 各剂量组和联苯双酯组按0.2 mL/10 g 体重灌胃给予相应药物，1 次/d，连续7 d。正常对照组和模型组灌胃给予等量生理盐水。末次给药1 h后，除正常对照组外，其他各组均注射含0.18% CCl4的花生油溶液[9]或D-Gal 溶液（700 mg/kg）[10]，复制两种小鼠急性肝损伤模型。正常对照组腹腔注射花生油或生理盐水。禁食不禁水20 h后取血和脏器进行测定。

1.5 血清生化指标的测定 各组小鼠采用眼球取血，4 ℃下3 000 r/min 离心10 min，取上层血清。按照试剂盒说明书步骤采用酶标法测定小鼠血清ALT、AST 和ALP 含量，全自动生化分析仪检测血清TBIL含量。

1.6 肝组织生化指标的测定 取肝大叶相同部位的小块肝组织，用4 ℃生理盐水漂洗去积血，滤纸拭干后称重，加适量4 ℃生理盐水配制10%的肝匀浆，4 ℃下3 500 r/min 离心20 min 后，取上清液。按照试剂盒说明书步骤分别测定肝组织中MDA、GSH含量和GSH-Px、SOD活性。

1.7 脏器指数的计算 眼球取血后处死小鼠，称重，迅速取出肝脏及脾脏，计算脏器系数：肝脏指数=肝脏重量（g）/体重（g）×100%，脾脏指数=脾脏重量（mg）/体重（g）×100%。

1.8 病理组织学检查[11]取一小块浸泡于10%甲醛溶液的肝左叶组织，常规脱水后，石蜡包埋，切片，行苏木精—伊红（HE）染色，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察肝组织的病理损伤情况。

1.9 免疫组化法检测肝组织PCNA、Bax、Bcl-2 蛋白表达 取适量肝脏组织，制备石蜡切片，放在60 ℃烤箱中烘烤1 h，切片室温冷却后置于4 ℃冰箱保存，按照免疫组化检测试剂盒说明书测定肝组织PCNA、Bax、Bcl-2蛋白表达。细胞质或胞核含棕黄色颗粒者为阳性细胞。采用Image-Pro Plus 软件分析，计算累计光密度值（IOD）。

1.10 统计学方法 用SPSS 22.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清ALT、AST、AL含量比较 与正常对照组比较，CCl4及D-Gal模型组血清ALT、AST、ALP活性和TBIL 含量升高（P＜0.01）；与相应模型组比较，SZZJYE 各剂量组ALT、AST、ALP 活性和TBIL含量降低（P＜0.05），见表1、表2。

表1 SZZJYE对CCl4所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影响 ±s，n=10

表1 SZZJYE对CCl4所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影响 ±s，n=10

与正常对照组比较，△P＜0.01；与CCl4模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表2 SZZJYE对D-Gal所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影响 ±s，n=10

表2 SZZJYE对D-Gal所致急性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP及TBIL含量的影响 ±s，n=10

与正常对照组比较，△P＜0.01；与D-Gal模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 各组肝组织氧化应激相关指标含量的比较

与正常对照组比较，CCl4及D-Gal 模型组肝组织MDA 含量升高，GSH 含量及SOD、GSH-Px 活性降低（P＜0.05）；与相应模型组比较，SZZJYE各剂量组MDA 含量降低，GSH 含量及SOD 和GSH-Px 活性升高（P＜0.05），见表3、表4。

表3 SZZJYE对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影响 ±s，n=10

表3 SZZJYE对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影响 ±s，n=10

与正常对照组比较，△△P＜0.05，△P＜0.01；与CCl4模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 SZZJYE对D-Gal所致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影响 ±s，n=10

表4 SZZJYE对D-Gal所致急性肝损伤小鼠肝组织SOD、MDA、GSH、GSH-Px水平的影响 ±s，n=10

与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与D-Gal模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 各组肝组织病理学改变 HE 染色结果显示，正常对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝细胞结构完整，呈放射状行走；CCl4及D-Gal模型组小鼠肝小叶结构消失，肝细胞大片凝固性坏死，并伴有炎性细胞浸润，中央静脉不规则扩张；与相应模型组比较，SZZJYE各剂量组肝组织病理形态学改变较模型组均有明显改善，且SZZJYE高剂量组改善更为明显，见图1。

图1 肝组织HE染色图（×200）

2.4 各组小鼠脏器指数及肝组织PCNA、Bcl-2、Bax蛋白表达量比较 与正常对照组比较，CCl4及DGal模型组肝脏指数、脾脏指数均升高，CCl4模型组PCNA 蛋白表达下降，D-Gal 模型组Bcl-2 蛋白表达量降低，Bax 蛋白表达量升高（P＜0.05）；与相应模型组比较，SZZJYE各剂量组肝脏指数、脾脏指数均降低，肝组织PCNA、Bcl-2 蛋白表达量升高，Bax 蛋白表达量下降（P＜0.05），见图2、表5、表6。

表5 SZZJYE对CCl4所致急性肝损伤小鼠脏器指数及肝组织PCNA蛋白表达的影响 ±s，n=10

表5 SZZJYE对CCl4所致急性肝损伤小鼠脏器指数及肝组织PCNA蛋白表达的影响 ±s，n=10

与正常对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与CCl4模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

表6 SZZJYE对D-Gal所致急性肝损伤小鼠脏器指数及凋亡相关蛋白表达的影响 ±s，n=10

表6 SZZJYE对D-Gal所致急性肝损伤小鼠脏器指数及凋亡相关蛋白表达的影响 ±s，n=10

与正常对照组比较，△P＜0.01；与D-Gal模型组比较，*P＜0.01。

图2 肝组织PCNA、Bcl-2、Bax蛋白的免疫组化染色图（×400）

3 讨论

CCl4作为急性肝损伤造模的经典药物，不仅广泛用于肝坏死及肝硬化的病因学、组织学研究和肝功能变化研究中，在药用植物提取物、保肝药物评价中也应用广泛[12-13]。D-Gal 建立的急性肝损伤模型，其导致的肝细胞弥漫性坏死和炎症反应与人类病毒性肝炎极为相似，故常应用于保肝药物的筛选及作用机制的研究[14]。

ALT、AST 是急性肝损伤的敏感指标[15-16]，当肝脏受损或发生炎症时，ALP和TBIL升高，TBIL升高会引起黄疸，也是临床判断急性肝损是重要依据[17]。CCl4和D-Gal 诱导小鼠肝细胞膜通透性增加，细胞内ALT、AST、ALP 释放入血，TBIL 含量升高，提示肝脏受到一定损伤，HE染色结果显示肝组织出现严重病理改变，细胞结构被破坏，炎性介质浸润，肝细胞坏死，急性肝损伤建模成功[18]。本研究中，SZZJYE 均能降低小鼠血清中ALT、AST、ALP活性和TBIL 含量，减轻肝细胞损伤；肝组织HE 染色结果也提示，经过SZZJYE 治疗后的小鼠肝脏坏死细胞减少，肝损伤程度有所减轻。

CCl4和D-Gal 诱导小鼠急性肝损伤后，机体氧化—抗氧化系统的失衡导致肝细胞氧化受损[19]，使肝脏SOD和GSH-Px活性丧失；另一方面，肝细胞膜脂质过氧化产生大量过氧化物MDA，进一步加重细胞功能损伤。因此，检测肝脏中SOD、GSH-Px水平和GSH、MDA含量，可以反映小鼠肝细胞脂质过氧化性损伤的严重程度[20]。本实验结果显示，SZZJYE 高、中、低剂量组SOD、GSH-Px 的活性和GSH含量提高，MDA含量降低，其中高剂量组效果最优，表明SZZJYE可通过清除自由基、抗脂质过氧化来减轻肝细胞损伤。

肝细胞凋亡也是急性肝损伤的另外一种基本特征[21]。PCNA 是DNA 聚合酶δ 的辅助蛋白，其表达反映了细胞再生功能的程度[22]。Bcl-2 通过阻止线粒体释放细胞色素C 而抑制细胞凋亡，其同源相关蛋白为Bax，当Bcl-2高表达时，Bax/Bax二聚体解离增多，形成更为稳定的Bax/Bcl-2 异源二聚体，凋亡被抑制[23]。本研究免疫组化结果显示，CCl4和DGal诱导后，PCNA和Bcl-2蛋白表达量下降，Bax表达量升高，提示模型组小鼠肝细胞进入凋亡状态；与相应模型组比较，不同剂量SZZJYE 均能上调小鼠肝细胞PCNA和Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，说明SZZJYE预处理能够修复肝细胞功能、抑制肝细胞凋亡，从而达到保护肝脏的作用。

综上，SZZJYE 对小鼠急性肝损伤有一定的保护作用，其机制可能与抑制脂质过氧化、清除自由基、修复肝细胞功能及抗凋亡有关。