类固醇激素分泌功能的肾上腺三维培养体系的建立*

郭雅婕，王逸夫，郭冰倩，姜经航，叶 雨，陈虹霏，陈 阳，廖金玲，莫曾南，，蒋永华△

（1.广西医科大学基因组与个体化医学研究中心，南宁 530021；2.广西医科大学再生医学与医用生物资源开发应用协同创新中心，南宁 530021；3.广西医科大学第一附属医院，南宁 530021；4.广西医科大学第二附属医院，南宁 530007）

由于肾上腺动物模型常常受到胎儿肾上腺结构、类固醇生成途径和妊娠内分泌学的显著物种特异性差异限制，目前关于肾上腺器官模型建立的研究较少。体外模拟具有类固醇分泌功能的肾上腺皮质三维培养体系，有助于从细胞及分子水平上对肾上腺疾病致病机制及药物治疗的研究。如先天性肾上腺增生（CAH）[1]，肾上腺皮质癌（ACC）[2]等疾病。

目前，人类肾上腺类器官培养研究，包括胚胎组织碎片培养[3]以及原代胚胎肾上腺细胞来源的三维结构培养[4]，前者保留肾上腺形态、细胞活力和持续的高类固醇生成活性，对于ACTH 刺激和抑制都有特定的生物学反应，但其组织块培养容易使培养团块中心性坏死；后者主要描述一群不同胎龄来源下，具有重建组织和功能分区结构能力的干细胞群，维持了人类胚胎肾上腺发育过程中的特定功能阶段，但其没有产生激素的特有内分泌功能。

以上两种培养方案都仅靠细胞黏附作用成球生长，培养球体中心细胞容易缺氧导致细胞死亡，且其培养条件未满足其肾上腺皮质区域生长迁移特点。另外，典型的Wnt 信号通路对胚胎的建立和肾上腺皮质稳态的维持具有重要作用[5-6]。有研究表明，肾上腺中富集于β-catenin 的fibroblast growth factor receptor-2（Fgfr2）通过调节细胞黏附连接的丰度和聚集特性，维持肾上腺皮质组织形态[7]。因此，本研究将两者结合，通过Matrigel 构建三维培养骨架，添加fibroblast growth factor（FGF2）和激活Wnt信号通路的小分子化合物CHIR99021、R-spondin1，构建具有类固醇激素分泌功能且受促肾上腺皮质激素（ACTH）调控的肾上腺三维培养体系，为肾上腺皮质疾病的研究奠定细胞生物基础。

1 材料与方法

1.1 组织来源

人胚胎肾上腺组织取自2019—2020 年于广西医科大学第二附属医院流产胚胎样本。本研究经广西医科大学第二附属医院伦理委员会批准（KY-0096）。

1.2 主要试剂和仪器

低黏附培养皿（Corning，3471），低生长因子无酚红的基质胶（356231GFR-Matrigel，Corning），RPMI 1640（Gibco，C11875500BT），DMEM/F12 培养基（12634010，Life technologies），TL 酶（Roche，5401020001），DNase Ⅰ酶（Roche，10104159001），无血清培养代替物N2（17502048，Life technologies），B-27 supplement minus vitamin A（12587010，Life technologies），谷氨酰胺（Gbico，25030081），血清FBS（Gibco，21 700075；HyClone，3007.03），生长因子FGF2（100-18C，Peprotech），原代细胞抗生素primocin（ant-pm-1，Invivogen），CHIR99021（4423，Tocris），R-spondin1（4645-RS，Bio R&DTechne），促肾上腺皮质激素ACTH（12279-41-3，MedChemExpress），抗 体CYP17A1（sc-374244，Santa），Dax1（ab97369，abcam），二抗Alexa Fluor 594-conjugated donkey anti-mouse IgG（1∶500，ab150112，Abcam），Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG（1∶500，ab150061，Abcam），DAPI（4083S，CST）。ELISA（DEHA，PROG，PREG，Cortisol）试剂盒购自江苏科晶生物有限公司。凝胶成像分析系统（Image Quant LAS500），Epoch2 微孔板分光光度计（Gen5TSCH 2.06 软件），Roche light Cycler 480 RTqPCR 仪，共聚焦显微镜（TCS SP8，Laika Microscope System Shanghai Trading Co，Ltd）。

1.3 溶液的配制

转移液：RPMI 1640 培养基中加入10% FBS。消化液：RPMI 1640 培养基中加入0.1 mg/mL TL，1 mg/mL DNase Ⅰ。含血清培养液：DMEM/F12 培养基中加入10%FBS，1X L-glutamine。无血清培养液：DMEM/F12 培养基中加入1X N2，1X B-27 supplement minus vitamin A，1X L-glutamine，100 μg/mL primocin；再添加100 ng/mL FGF2，1.5 μmol/L CHIR99021，5 ng/mL recombinant human R-spondin1，200 nmol/L ACTH。

1.4 单个细胞的制取

取手术流产胚胎肾上腺，严格遵循无菌操作原则，样本放入转移液中保存。取回的胚胎肾上腺样本放入EP管中，用PBS冲洗，去除血液，表面杂质。清理干净的组织放入培养皿中用眼科剪剪碎组织，重悬至消化液消化（37 ℃，20 min），待肉眼看不到组织碎块用含10%血清的PBS终止，过100 μm的筛网获得单个细胞，最后用含1%血清的PBS清洗两次，重悬计数。

1.5 球状体的构建

第1 天，将Matrigel 与冰DMEM/F12 以1∶20 体积稀释混匀加入低黏附培养皿，置于37 ℃培养箱预包被，待1 h 培养基呈胶状后弃上清液。将单个细胞悬液再用培养液重悬调整细胞浓度至1.5×105/mL，沿培养皿壁边缘缓缓加入孔内，放置培养箱中培养（37 ℃，5%CO2）。第2 天，弃上清，Matrigel 与培养基以1∶40 体积稀释加入培养皿内。第3 天成球后，用不含Matrigel 的培养基换液，每隔3 d 更换1 次培养基，每隔1 周传代。第1～第11 天，在DMEM/F12+10% FBS+1% Glu 条件下培养。第12 天后，无血清培养：DMEM/F12+N2+B27+1%Glu。通过不同培养时间添加因子，进行以下比较：（1）第12 天，添加FGF2，48 h 后光镜下观察其形态变化；（2）第15 天，再添加CHIR99021、R-spondin1，48 h 后测定Wnt 信号通路相关基因的表达，及苏木精伊红染色。（3）第18天，鉴定肾上腺皮质关键基因及蛋白的表达后，ACTH刺激球体，48 h后测定上清液激素水平与ACTH刺激前比较。

1.6 球状体的传代，冻存和复苏

用巴氏吸管转移细胞球至15 mL 无菌离心管中，300 g 离心3 min，弃上清，加入3 mL Dispase 吹打重悬于60 mm 培养皿，放入培养箱酶解消化30 min。显微镜观察，球状体呈2～3 个细胞团块，用PBS 清洗小细胞团残留酶及胶状杂质。按照以上球状体构建步骤，进行预包被和换液。以1∶3 比例扩增传代。冻存液DMSO/FBS以1∶9比例冻存球状体，液氮保存。复苏时冻存管速融37 ℃至小冰晶，转移至15 mL离心管含10%FBS的1640培养基吹打混匀，300 g离心3 min，去除上清液，培养。

1.7 球状体包埋切片

将球状体放入4%的多聚甲醛固定36 h，琼脂糖凝胶包被20～30个类器官/块，再固定24 h。酒精梯度脱水（50%，70%，80%，90%，95%两次，100%两次）各20 min；二甲苯透明15 min重复2次；浸蜡3 h（65 ℃烘箱）。石蜡包埋（-20 ℃冰箱过夜）。切片机切4 μm厚度切片，粘载玻片，干燥。

1.8 苏木精—伊红染色观察Wnt 信号通路类器官形态特征

石蜡切片用二甲苯脱蜡10 min重复3次，酒精梯度透明（95%，80%，70%）各1 min，自来水冲洗1 min，甩干。滴加苏木精染液染5～10 min，自来水冲洗1～2 min；盐酸酒精分化液分化数秒，水洗；滴加返蓝液数秒，水洗1～2 min 甩干；滴加80%乙醇脱水1 min，再滴加伊红染液染色30～60 s。依次浸入80%乙醇，95%乙醇调色脱水，显色后浸入无水乙醇脱水2 min。透明封片，显微镜观察。

1.9 免疫荧光染色观察球状体中类固醇生成细胞标记物的表达

脱蜡、透明同上。EDTA水煮修复抗原，煮沸放入玻片，最低火力煮20 min；2% BSA 封闭（37 ℃，30 min）；一抗用2%BSA配制，混匀滴上组织（4 ℃，过夜）孵育；二抗（37 ℃，30 min）孵育；DAPI 染核。抗荧光衰减封片剂封片，共聚焦显微镜观察。

1.10 透射电镜的样本制备与观察

将10～20 个球状体用2.5%戊二醛4 ℃冰箱固定3 h，固定好的样本送至塞维尔生物科技制样、切片、染色及拍照。

1.11 荧光实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）测定关键基因的表达

用HiPure Universal RNA Kit（Magen）试剂盒提取细胞总RNA，PrimeScript RT Master Mix（TAKARA）逆转录。使用FastStart Essential DNA Green Master 试剂盒，于Roche Light Cycler 96 RTqPCR仪进行RT-qPCR。反应条件如下：94 ℃5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，40 个循环；72 ℃10 min。得到CT 值后计算2-ΔΔCT得到目的基因相对表达量，目的基因及引物序列见表1。

表1 目的基因及引物序列

1.12 RT-qPCR产物电泳鉴定

提取细胞总RNA，行RT-qPCR，PCR产物电泳，配制3%琼脂糖凝胶，加入核酸染料，1X TAE电泳缓冲液；置入电泳槽，每孔加入10 μL PCR 扩增产物；电压120 V，电流40 mA，电泳时间40 min；成像观察。

1.13 激素测定酶联免疫吸附（ELISA）测定细胞上清液激素

ELISA试剂盒，450 nm波长下测定标准品吸光度，绘制标准曲线（r2≥0.99）得到标准方程，代入样本所测吸光度，公式计算得出对应培养基上清中激素浓度。

1.14 统计学方法

采用GraphPad Prism数据处理。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 FGF2 有利于体外类器官培养细胞的增殖球体的形成

光镜下形态学观察，Matrigel 包被在含血清培养液中培养第1天可见大量双细胞，第2天可见3～5 个细胞团，第5 天后细胞聚集成球，并随着时间不断增大。第12 天添加FGF2 生长因子后，球体直径仍明显增大，直径可达约300 μm（图1）。

图1 光镜下细胞成球过程及生长情况（×10）

2.2 Wnt信号通路激活剂的添加有利于类器官球体结构的形成

RT-qPCR 结果显示，添加Wnt 信号通路激活剂后，Wnt/β-catenin 信号下游蛋白β-catenin、CyclinD1的mRNA 表达水平升高（均P＜0.05）；GSK-3β、PPAR-γ表达水平组间比较差异无统计学意义（均P＞0.05）（表2）。HE 染色结果对比显示，在其小分子化合物的作用下，球状体具有显著肾上腺外层致密内部疏松的组织特征，且与胚胎肾上腺结构相似（图2）。

图2 Wnt 信号通路类器官形态特征对比图（HE染色）

表2 qRT-PCR 检测GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 和PPAR-γ的mRNA相对表达水平 ±s

表2 qRT-PCR 检测GSK-3β、β-catenin、CyclinD1 和PPAR-γ的mRNA相对表达水平 ±s

2.3 获得的肾上腺类器官具有皮质激素合成功能

免疫荧光染色结果显示，球状体中类固醇生成细胞标记物DAX1、CYP17A1的表达（图3）。电泳分析结果显示，球状体具有类固醇生成因子SF-1的表达，甾体生成酶的基因表达CYP11A1、CYP11B1、CYP17A1、HSD3B2，以及ACTH 受体黑皮质素2 受体（melanocortin 2 receptor，MC2R）的表达（图4）。透射电镜结果显示，微观结构下球状体内部细胞呈现大量脂滴（LD），扩大的内质网（RER），丰富线粒体（M），滑面内质网（SER），细胞核（N）（图5）。

图3 球状体DAX1、CYP17A1的免疫荧光染色（×20）

图4 电泳观察球状体所含各类型细胞的标志物表达

图5 球状体中细胞的微观结构（×8.0 k）

2.4 获得的类器官受ACTH信号调控

ELISA 结果显示，与未添加ACTH 组比较，添加ACTH组刺激后，类器官培养上清液中类固醇相关激素包括孕酮、皮质醇均升高，差异有统计学意义（均P＜0.05），而两组孕烯醇酮、脱氢表雄酮比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表3。

表3 ELISA检测球状体培养上清液的激素水平ng/mL， ±s

表3 ELISA检测球状体培养上清液的激素水平ng/mL， ±s

3 讨论

本研究利用基质胶为体外生成的球状体提供了生长的支架。低生长因子（growth factor reduce，GFR）的Matrigel 基底膜基质适用于对基质成分要求严格的实验，如细胞信号通路和细胞因子的研究等。本课题组采用GFR-Matrigel 通过添加各种肾上腺相关生长因子和小分子化合物方法，以模拟细胞体内生长环境的体外培养。该方法依赖对肾上腺相关信号通路的激活，如FGF2、Wnt、PKA信号通路。因此本研究添加了以下信号激活相关因子：生长因子FGF2，调节Wnt 信号通路[5，8]的CHIR99021和R-spondin1，以及ACTH。

肾上腺皮质组织的更新和重塑，对于三维立体模型的建立至关重要。典型的Wnt 信号通路对胚胎的建立和肾上腺皮质稳态的维持具有重要作用[5-6]。在肾上腺早期发育过程中，Wnt/β-catenin 信号通过维持祖细胞处于未分化状态[9]，在皮质向心更新中发挥重要作用[10]。此外，Wnt 信号通路还可以通过诱导旁分泌因子直接影响细胞的迁移、黏附和极性[9，11]，如FGF 信号通路[7，12]来调控形态发生。成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）的表达对维持皮质细胞的生长和增殖至关重要[12-13]。因此，添加Wnt信号通路激活剂CHIR99021和R-spondin1和生长因子FGF2，维持了球状体内皮质细胞的生长和增殖，促进皮质的更新有利于三维球体的重塑。本文对其形态学观察，可见球状体直径有明显的增加，且具备肾上腺外层致密内部疏松的组织特征。类固醇细胞透射电镜下的微观结构特点有以下几点：（1）扩张的粗面内质网以及丰富的光滑内质网呈髓鞘状；（2）细胞线粒体较多、嵴清晰、呈半层状；（3）胞质内有较多的脂滴。因此，从细胞学角度，肾上腺类器官微观结构下具备以上特征，免疫荧光染色结果同样显示球状体具有类固醇细胞标志物DAX1、CYP17A1的表达，可初步得出球状体内具有类固醇生成样细胞。

人肾上腺皮质类固醇细胞产生的皮质醇雄激素由HPA轴控制。ACTH通过激活cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）信号，刺激肾上腺束状带皮质细胞产生皮质醇[14-15]。肾上腺皮质细胞表面的MC2R在介导ACTH 的分泌和随后的类固醇形成中发挥重要作用[14，16]。因此，本实验对PCR 产物电泳验证了球状体具有类固醇生成因子SF-1；甾体生成酶的基因（CYP11A1、CYP11B1、CYP17A1）[17]；以及MC2R基因的和糖皮质激素合成的关键基因HSD3B2的表达。因此，在PKA 信号通路的调控下添加ACTH后，检测到皮质醇激素升高，进而模拟了肾上腺束状带细胞的生物学功能。

本文研究了一种目前较为前沿的利用Matrigel构建体外扩增和分化人肾上腺细胞的三维培养方法，与传统的二维细胞培养相比，三维培养具有包含多种细胞类型，更加接近体内组织结构的优势，有利于建立细胞间广泛的链接和细胞通讯，进而有利于细胞的分化，能更好地用于模拟人类器官组织的发生过程及生物学功能[18]。通过添加激活肾上腺发育通路的小分子化合物，探索了胚胎肾上腺来源的细胞体外三维培养体系。本课题组对培养的肾上腺球状体进行形态学、基因表达、蛋白表达和重要的体外功能包括肾上腺的激素分泌功能等方面进行验证，说明其与肾上腺在组织、细胞及功能层面鉴定结果基本一致的肾上腺球状体皮质区域结构[19-20]。为肾上腺体外模拟及治疗提供了新策略。

本实验通过电泳的方法，观察其所含的细胞标志物基因表达，但仍需进一步应用免疫荧光技术将所用细胞类型完整标记出来。为促进其更加稳定的培养及鉴定，笔者将从培养基的制备、传代方法、包埋切片等方面完善肾上腺的培养和标本制备方法，向肾上腺类器官能大规模培养和广泛鉴定发展，为发育生物学的研究提供一个基本的研究模型，有利于再生医学、基因治疗的研究。