二去水卫矛醇对人非小细胞肺癌H460细胞体内抗癌活性及其机制研究*

周 莹，刘华钢，孙悦文，李健哲，陈清洁，张小军

（1.广西中医药大学附属瑞康医院药学部，南宁 530001；2.广西医科大学药学院，南宁 530001）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）发生率约占肺癌的75%～80%，5年生存率仅8%～15%，手术、化疗、放疗是NSCLC 的主要治疗手段[1]。传统化疗方案5年总体生存率（OS）改善不理想，且毒副反应较多，寻找有效且安全的抗肿瘤药迫在眉睫。二去水卫矛醇（1,2:5,6-dianhydrogalactitol，DAG）是一种以植物卫矛醇为原料提取的广谱抗肿瘤药，其对白血病有较好的疗效，对肺癌、原发性脑瘤等亦具有一定治疗效果[2]。

体外研究发现，DAG 能有效抑制白血病细胞、黑色素瘤细胞、乳腺肿瘤细胞、肺癌细胞、脑肿瘤细胞等，且其机制与诱导细胞凋亡有关[3-7]，但尚未探索DAG 对人NSCLC H460 细胞体内抗癌活性及其作用机制。本研究通过建立人NSCLC H460细胞裸鼠移植瘤模型，探讨DAG 对人NCI-H460 肺癌细胞体内抗癌的作用与机制，为证实DAG 体内抗癌活性、临床应用提供研究基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物和主要试剂 人NSCLC H460细胞株购于上海细胞库。注射用DAG 购自广西梧州制药（集团）股份有限公司，批号：131101；注射用顺铂（DDP）购自山东齐鲁制药有限公司。CCK-8 试剂盒（日本DOJINDO 化学研究所）；TUNEL 原位末端标记检测试剂盒（德国罗氏公司）；RNAiso Plus、RNase Free、DL500DNA Marker、Loading buffer（大连TaKaRa 公司）；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）逆转录试剂盒、SYBR Green Ⅰ检测试剂盒（日本Takara公司）；Bax、Bcl-2、P53、GAPDH和HRP标记的山羊抗兔二抗均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 实验动物和裸鼠移植瘤模型的建立 SPF 级BALB/c 裸鼠，4～6 周龄，雌雄各半，体重18～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK 京2012-0001；饲养于广西医科大学实验动物中心SPF级动物房内。

裸鼠适应性喂养1 周后，取对数生长期的人NSCL CH460细胞，消化重悬为单个细胞，PBS缓冲液洗涤细胞2次后，用PBS重悬细胞，调整细胞密度为2×106个/mL。将0.2 mL 细胞重悬液皮下注射到每只裸鼠右侧前肢腋窝下部的同一部位和深度，待肿瘤体积达到200 mm3为模型建立成功。

1.3 实验分组和给药 将造模成功后的裸鼠随机分为模型组、DAG 低剂量组（DAG-L 组，3 mg/kg）、DAG 中剂量组（DAG-M 组，6 mg/kg）、DAG 高剂量组（DAG-H 组，9 mg/kg）和阳性对照组（顺铂，3 mg/kg），每组6 只。各组均通过腹腔注射给药，1 次/d，连续7 d，按0.2 mL/20 g体重计算药量，模型组腹腔注射等量生理盐水。每次给药前测量裸鼠体重和肿瘤体积（V），V=[1/2×肿瘤长径（a）×短径（b）2]。给药结束后颈椎脱臼法处死各组裸鼠，剥离移植瘤，称瘤重，计算抑瘤率，抑瘤率=（模型组瘤重－给药组瘤重）/模型组瘤重×100%。

1.4 TUNEL法检测肿瘤组织细胞凋亡 取部分肿瘤组织于10%多聚甲醛溶液中固定24 h 后制作石蜡切片，进行脱蜡、水合、蛋白酶处理，PBS 漂洗切片，加入TUNEL反应液，PBS漂洗，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，风干后中性树胶封片，光学显微镜观察并拍照。每张切片选取5 个阳性细胞数最多的高倍视野（×200），计数视野下所有的细胞数和阳性细胞数，计算细胞凋亡率，即阳性细胞数占细胞总数的百分比。

1.5 RT-qPCR 法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 和P53 mRNA 相对表达量 取肿瘤组织，Trizol 法提取总RNA，逆转录成cDNA，进行PCR扩增，PCR 反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火、延伸31 s，共40 个循环。所有引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，Bax 上游：5’-GACGAACTGGACAGTAACATGGA-3’，下游：5’-GCAAAGTAGAAAAGGGCGACA-3’，产物长度为149 bp；Bcl-2 上游：5’-AACATCGCCCTGTGGATGAC-3’，下游：5’-AGAGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3’，产物长度为146 bp；Caspase-3上游：5’-GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA-3’，下游：5’-AGGTTTGCTGCATCGACATCTG-3’，产物长度为140 bp；Caspase-9 上游：5’-TCCAGGAAGGTTTGAGGACC-3’，下游：5’-CCCTTTCACCGAAACAGCAT-3’，产物长度为230 bp；P53 上游：5’-TTTGAGGTGCGTGTTTGTGC-3’，下游：5’-GCCTCATTCAGCTCTCGGAA-3’，产物长度为366 bp；GAPDH 上游：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，产物长度为138 bp。采用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。

1.6 Western blotting 法检测P53、Bcl-2 和Bax 蛋白表达 将肿瘤组织充分研磨后，加入裂解液充分裂解，离心，取上清液得到蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度，煮沸使蛋白变性；按每孔30 μg 蛋白上样，电泳分离蛋白，将蛋白转到PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h；加入一抗P53、Bcl-2、Bax（均1∶1 000）4 ℃冰箱孵育过夜，洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶10 000）室温下孵育1 h，洗膜；ECL 显影液曝光显影，Image J软件分析蛋白条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAG对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 各组裸鼠的饮食均无明显异常，模型组裸鼠体重持续增加，移植瘤体积逐渐增大，而DAG 各剂量组和阳性对照组裸鼠体重和移植瘤体积增加缓慢，见图1；给药7 d 后剥离瘤体检测结果显示，与模型组比较，DAG 各剂量组和阳性对照组瘤体体积和瘤重减小（P＜0.05），抑瘤率均高于40%；与阳性对照组比较，DAG-M组、DAG-H组瘤体体积和瘤重减小（P＜0.05）；与DAG-L 组比较，DAG-M 组、DAG-H 组瘤重减小（P＜0.05），见图2、表1。

表1 各组裸鼠移植瘤体积和重量比较 ±s，n=6

表1 各组裸鼠移植瘤体积和重量比较 ±s，n=6

与模型组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05；与DAG-L组比较，&P＜0.05。

图1 各组不同时间裸鼠体重和移植瘤体积比较

图2 给药7 d后各组肿瘤大小比较

2.2 DAG 对肿瘤细胞凋亡的影响 与模型组（1.21%±1.05%）比较，DAG-L 组（6.34%±1.67%）、DAG-M组（41.03%±1.96%）组、DAG-H组（75.13%±2.06%）和阳性对照组（18.60%±1.45%）肿瘤细胞凋亡率均增高（均P＜0.05）；与阳性对照组比较，DAG-M组、DAG-H组肿瘤细胞凋亡率增高（均P＜0.05）；与DAG-L 组比较，DAG-M 组、DAG-H 组肿瘤细胞凋亡率增高（均P＜0.05），见图3。

图3 各组肿瘤组织TUNEL染色图（×200）

2.3 DAG对肿瘤组织凋亡相关基因表达的影响

与模型组比较，DAG-M组、DAG-H组和阳性对照组Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA 相对表达量升高，DAG-L 组Caspase-9 mRNA 相对表达量升高，DAG 各剂量组Bcl-2 mRNA 相对表达量均降低（均P＜0.05）；与阳性对照组比较，DAG-H 组Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA 相对表达量升高，DAG-M组Bax、Caspase-9 mRNA相对表达量升高，DAG-L组和DAG-H组Bcl-2 mRNA相对表达量降低（均P＜0.05）；与DAG-L组比较，DAG-M组、DAG-H 组Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA 相对表达量升高，DAG-H组Bcl-2 mRNA相对表达量降低（均P＜0.05），见表2。

表2 各组肿瘤组织Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA相对表达量比较 ±s，n=6

表2 各组肿瘤组织Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、P53 mRNA相对表达量比较 ±s，n=6

与模型组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05；与DAG-L组比较，&P＜0.05。

2.4 DAG对肿瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响

与模型组比较，DAG各剂量组Bax、P53蛋白相对表达量升高，Bcl-2 蛋白相对表达量降低（均P＜0.05）；与阳性对照组比较，DAG-M 组、DAG-H 组Bax、P53 蛋白相对表达量升高，DAG-L 组Bax 蛋白相对表达量升高，DAG 各剂量组Bcl-2 蛋白相对表达量降低（均P＜0.05）；与DAG-L 组比较，DAG-M组、DAG-H 组P53 蛋白相对表达量升高（均P＜0.05），见图4、表3。

表3 各组肿瘤组织凋亡相关蛋白表达量比较 ±s，n=6

表3 各组肿瘤组织凋亡相关蛋白表达量比较 ±s，n=6

与模型组比较，*P＜0.05；与阳性对照组比较，#P＜0.05；与DAG-L组比较，&P＜0.05。

图4 Western blotting蛋白电泳图

3 讨论

DAG是新型的植物生物碱类抗肿瘤药，为广谱抗肿瘤药物，具有毒性小、易溶于水、抗肿瘤活性高等优点。该药目前已经上市，并主要用于治疗慢性粒细胞白血病，其主要的作用机制是通过本身或派生的环氧基团的烷基化作用，使DNA 烷基化，从而抑制DNA 合成，进而诱导细胞凋亡，推测的作用机制还包括抑制RNA和蛋白质合成[8]。本研究结果显示，与模型组比较，DAG 各剂量组肿瘤细胞凋亡率增高，且DAG-H 作用最显著。初步说明了DAG 在裸鼠体内可诱导H460肺癌细胞凋亡。

经典的细胞凋亡途径主要有3 条：细胞内的线粒体途径、细胞内的内质网途径及细胞表面的死亡受体途径[9]。与凋亡相关的基因有很多，研究较多的是抑癌基因P53、Bcl-2家族和Caspase家族[10]。其中P53 基因是一个强大的“基因组卫士”，它不仅能够调节大约200余种与细胞周期凋亡、自噬、衰老等密切相关的下游蛋白表达[11]，还能够激活凋亡效应分子而诱导凋亡。Bax 和Bcl-2 同属于Bcl-2 家族，主要是线粒体途径中控制凋亡因子释放的主要调节者[12]，在P53 的刺激下，凋亡因子Bax 表达上调，从而诱导细胞凋亡；反之，抗凋亡因子Bcl-2过表达可以阻止细胞调亡[13-14]。Caspase家族是直接导致凋亡细胞死亡的蛋白酶系统，在细胞凋亡过程中起着关键性作用，其中Caspase-3、Caspase-9 作为凋亡信号传递通路的汇聚点，可被多种凋亡信号激活，参与细胞凋亡的调控[15-16]。赖祥进等[17]研究发现，二乙酰二脱水卫矛醇通过促进P53基因表达对肝癌细胞的生长发挥抑制作用；杨锦南等[18]研究发现，二乙酰二脱水卫矛醇可在体内诱导白血病HL-60 细胞凋亡，其机制与Bcl-2 蛋白表达下调、Bax 蛋白表达上调有关；邓晓慧等[19]研究发现，Caspase-3 在乙酰二脱水卫矛醇诱导的细胞凋亡中起重要作用。

本研究在明确了DAG在裸鼠体内诱导人NCIH460 肺癌细胞凋亡的基础上，通过RT-qPCR 和Western blotting法检测肿瘤组织细胞凋亡相关基因和蛋白表达变化，初步探讨DAG在体内可能的促凋亡机制。实验结果显示，DAG-M、DAG-H 可诱导Bax、Caspase-3、Caspase-9、P53表达明显上调，Bcl-2表达下调。结果提示DAG 作用后可能激活了细胞凋亡的线粒体途径，从而诱导细胞凋亡。此外，与阳性对照顺铂相比，DAG-M、DAG-H肿瘤组织TUNEL 阳性凋亡率增高。提示DAG 抗肿瘤、诱导肿瘤细胞凋亡的效果可能优于作为NSCLC 一线治疗用药的顺铂，但仍有待进一步研究证实。

综上所述，DAG 能有效抑制裸鼠NSCLC 的生长，其机制可能与诱导线粒体凋亡途径相关。本组将深入探讨DAG诱导裸鼠体内人NSCLC凋亡的机制，并通过构建其他肿瘤裸鼠皮下移植瘤模型观察DAG 体内抑制多种肿瘤的作用及其分子机制，为DAG的临床应用、增加适应证提供可靠的依据。