基于PSMA3-AS1研究黑加仑提取物对肺癌细胞周期、凋亡和迁移的影响*

俞 杰，陈卫荣，黄 勇

（江苏省南通市海门区人民医院胸外科，南通 226100）

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高趋势[1]。放疗和化疗是晚期肺癌患者的常用治疗方法，但毒副作用大，长期使用易使肿瘤细胞产生抗性，限制了其在临床中的应用[2]。因此，亟需寻找新的副作用小的治疗肺癌的药物。黑加仑是虎耳草科茶藤属植物黑醋栗的浆果，富含维生素、多酚、酚酸等多种生物活性成分，具有抗氧化、降血压、抗肿瘤等功效[3-4]。研究显示，黑加仑水提物可通过诱导细胞凋亡来抑制人食管癌细胞株Eca109细胞的生长[5]。但目前尚无黑加仑提取物影响肺癌细胞恶性生物学行为的相关报道。

PSMA3基因的反义RNA1（PSMA3-AS1）是一种长链非编码RNA（lncRNA），其在肺癌组织和细胞系中的表达升高。PSMA3-AS1 高表达与肺癌患者临床分期、转移及预后不良密切相关，敲低PSMA3-AS1 可降低肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[6]。因此，本研究旨在探究黑加仑提取物对肺癌细胞A549细胞周期、凋亡和迁移的影响及其对PSMA3-AS1的调控作用，为其新药研发和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂 肺癌细胞系A549（中国科学院上海细胞库）。胎牛血清（FBS，浙江天杭生物公司）；RPMI 1640 培养基、细胞周期检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒和BCA 蛋白检测试剂盒（北京索莱宝）；LipofectamineTM2000 试剂盒（美国Invitrogen 公司）；PSMA3-AS1 过表达载体（pcDNA-PSMA3-AS1）、空载体（pcDNA）和PCR 引物（上海生工）；兔抗人Bcl-2、Bax 和GAPDH 抗体（美国Santa Cruz 公司）；Trizol 试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒（大连宝生物）。

1.2 黑加仑提取物的制备 黑加仑干燥，粉碎后，过100 目筛。准确称取200 g 干燥粉末，以1∶10（g/mL）加70%乙醇，进行超声提取。超声条件：功率30 kW，温度37 ℃，提取时间30 min，提取2次，抽滤，合并滤液。旋转浓缩至10 mL 左右，冷冻干燥。制备100 mg/mL母液，过滤除菌后置于-20 ℃冰箱中保存，使用时用培养基稀释至所需浓度。

1.3 细胞培养和转染 用含10% FBS 的RPMI 1640 培养基培养A549 细胞。将对数期A549 细胞接种于6 孔板中（5.0×105个/孔），用LipofectamineTM2000 脂质体法，分别转染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA。转染6 h 后，更换培养基。再培养24 h，收集细胞用于后续实验。

1.4 细胞分组和处理 将A549细胞分为对照组和不同浓度黑加仑提取物组，其中对照组细胞用含10%FBS 的RPMI 1640 培养基培养，不同浓度黑加仑提取物组细胞分别用含5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL[7]黑加仑提取物的培养基培养。

转染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA 的A549 细胞用含10%FBS 的RPMI 1640 培养基培养，分别记为pcDNA-PSMA3-AS1 组、pcDNA 组。转染pcDNA-PSMA3-AS1、pcDNA 的A549 细胞用含15 mg/mL黑加仑提取物的培养基培养，并分别记为15 mg/mL 黑加仑提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 组、15 mg/mL黑加仑提取物+pcDNA组。

1.5 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 将A549细胞接种于24 孔板中（5.0×104个/孔），按不同分组处理细胞，培养24 h 后，收集细胞。（1）PBS 清洗细胞2次，加入1 mL 70%乙醇，混匀，4 ℃固定12 h；1 000 r/min 离心5 min，弃上清，加1 mL PBS，重悬细胞，1 000 r/min 离心5 min，弃上清；加入0.5 mL PI 溶液室温下避光染色30 min，上流式细胞仪检测细胞周期。（2）调整细胞密度为5.0×105个/mL，PBS 清洗细胞2 次，1 000 r/min离心5 min，弃上清；加入500 μL结合缓冲液，重悬细胞；加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温下避光孵育15 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6 划痕实验检测细胞迁移 将A549细胞接种于24 孔板中（5.0×104个/孔），用200 μL 微量吸液枪头沿板中轴在单层细胞划痕。PBS 洗去划掉细胞，测定划痕间宽度，记为0 h 宽度。按不同分组处理细胞，培养24 h 后，再次测量宽度，记为24 h 宽度，计算划痕愈合率。划痕愈合率（%）=（0 h宽度-24 h宽度）/0 h宽度×100%。

1.7 Western blotting 法检测细胞Bcl-2 和Bax 蛋 白表达 用RIPA 试剂提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量；SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，封闭，加入一抗Bcl-2（1∶500）、Bax（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）4 ℃孵育过夜；洗膜，山羊抗兔二抗（1∶2 000）室温下孵育1 h；洗膜，加显影液避光显影，曝光，拍照。采用Image J 软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.8 RT-qPCR 法检测PSMA3-AS1 mRNA 相对表达量 用Trizol 试剂提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，在T100 型PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）上进行PCR 扩增。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 个循环。引物序列如下：PSMA3-AS1 上游：5'-AACAGACCATCAGAAGAGAACA-3'，下 游：5'-GAACAGAAACCAGAGCCATACA-3'；GAPDH 上游：5'-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3'，下游：5'-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3'。用2-△△Ct法计算PSMA3-AS1 mRNA相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件分析实验数据。计量资料以均数±标准差（）表示。多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 黑加仑提取物对A549细胞周期的影响 与对照组比较，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加仑提取物组A549 细胞周期G0～G1 期延长，S 期缩短（均P＜0.05），而G2～M期无明显差异（P＞0.05）；5 mg/mL黑加仑提取物组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；随着黑加仑提取物浓度的增加，G0～G1期延长，S期缩短（均P＜0.05），而G2～M期组间无明显差异（P＞0.05），见图1。

图1 4组A549细胞周期的比较

2.2 黑加仑提取物对A549 细胞凋亡和迁移的影响 与对照组比较，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加仑提取物组A549 细胞凋亡率升高，划痕愈合率降低，Bax 蛋白表达升高，Bcl-2 蛋白表达降低（均P＜0.05），而5 mg/mL黑加仑提取物组各检测指标均无明显差异（P＞0.05），不同浓度黑加仑提取物组间各检测指标两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图2。

图2 4组A549细胞凋亡率、凋亡相关蛋白表达及细胞迁移能力的比较

2.3 黑加仑提取物对A549 细胞中PSMA3-AS1 表达的影响 对照组和5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL黑加仑提取物组A549 细胞中PSMA3-AS1 表达分别为1.00±0.00、0.97±0.05、0.68±0.04 和0.29±0.02（F=290.222，P＜0.05），与对照组比较，10 mg/mL、15 mg/mL 黑加仑提取物组A549 细胞中PSMA3-AS1表达显著降低（P＜0.05），而5 mg/mL黑加仑提取物组PSMA3-AS1 表达无明显差异（P＞0.05），不同浓度黑加仑提取物组间PSMA3-AS1表达两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.4 过表达PSMA3-AS1 对黑加仑提取物处理的A549 细胞周期及PSMA3-AS1 表达的影响 与pcDNA组比较，15 mg/mL黑加仑提取物+pcDNA组A549细胞中PSMA3-AS1表达降低，A549细胞周期G0～G1 期延长，S 期缩短（均P＜0.05），G2～M 期无明显差异（P＞0.05），而pcDNA-PSMA3-AS1 组A549细胞中PSMA3-AS1表达升高（P＜0.05），细胞周期G0～G1 期缩短，S 期延长（均P＜0.05），G2～M 期无明显差异（P＞0.05）。与pcDNA-PSMA3-AS1 组比较，15 mg/mL 黑加仑提取物+pcDNA-PSMA3-AS1组A549细胞中PSMA3-AS1表达降低，细胞周期G0～G1 期延长，S 期缩短（均P＜0.05），而G2～M 期无明显差异（P＞0.05）。与15 mg/mL 黑加仑提取物+pcDNA组比较，15 mg/mL黑加仑提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 组A549 细胞中PSMA3-AS1 表达升高，细胞周期G0～G1 期缩短，S 期延长（均P＜0.05），而G2～M 期无明显差异（P＞0.05），见图3。

图3 过表达PSMA3-AS1对黑加仑提取物处理的A549细胞周期及PSMA3-AS1表达的影响

2.5 过表达PSMA3-AS1 对黑加仑提取物处理的A549 细胞凋亡和迁移的影响 与pcDNA 组比较，15 mg/mL黑加仑提取物+pcDNA组A549细胞凋亡率升高，划痕愈合率降低，Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低（均P＜0.05），而pcDNA-PSMA3-AS1组A549 细胞凋亡率降低，划痕愈合率升高，Bax 蛋白表达降低，Bcl-2 蛋白表达升高（均P＜0.05）。与pcDNA-PSMA3-AS1组比较，15 mg/mL黑加仑提取物+pcDNA-PSMA3-AS1 组A549 细胞凋亡率升高，划痕愈合率降低，Bax 蛋白表达升高，Bcl-2 蛋白表达降低（均P＜0.05）。与15 mg/mL 黑加仑提取物+pcDNA 组比较，15 mg/mL 黑加仑提取物+pcDNAPSMA3-AS1 组A549 细胞凋亡率降低，划痕愈合率升高，Bax 蛋白表达降低，Bcl-2 蛋白表达升高（均P＜0.05），见图4。

图4 过表达PSMA3-AS1对黑加仑提取物处理的A549细胞迁移及凋亡的影响

3 讨论

黑加仑含有维生素、有机酸、多酚和矿物质等多种营养物质，是天然的保健食品。有报道称，1 mg/mL 的黑加仑提取物可抑制肝癌细胞QCY-7704 生长[8]。本研究结果显示，10 mg/mL、15 mg/mL 的黑加仑提取物可明显阻滞肺癌细胞周期进程，促进肺癌细胞凋亡，并抑制肺癌细胞迁移，说明黑加仑提取物可抑制肺癌细胞的恶性生物学行为，发挥一定的抗肺癌作用，具有治疗肺癌的潜在价值。细胞凋亡是一种程序性死亡过程，受多种基因的调控。Bax/Bcl-2是细胞凋亡的重要调控分子，其中Bax表达上调诱导细胞凋亡，而Bcl-2表达下调时则对细胞凋亡起抑制作用[9]。本研究发现，黑加仑提取物剂呈剂量依赖性地降低A549细胞中Bcl-2蛋白的表达，而促进了Bax蛋白的表达，进一步从蛋白水平说明黑加仑提取物可诱导肺癌细胞凋亡。

作为一种lncRNA，PSMA3-AS1 参与多种肿瘤的发展。研究显示，食管鳞状细胞癌（ESCC）组织中PSMA3-AS1表达明显上调，其高表达与ESCC患者肿瘤大小、远处转移和不良预后密切相关，过表达PSMA3-AS1 通过靶向调控miR-101/EZH2 轴促进体外ESCC 细胞增殖、侵袭和迁移，其可能为ESCC的治疗提供新的分子靶点[10]。干扰PSMA3-AS1表达可有效提高多发性骨髓瘤异种移植瘤对卡非佐米的敏感性[11]。敲低PSMA3-AS1 可靶向miR-302a-3p 抑制RAB22A 的表达，在体内、体外降低神经胶质瘤细胞迁移、增殖和侵袭能力，表明PSMA3-AS1 可作为神经胶质瘤的治疗和预后潜在靶标[12]。PSMA3-AS1可靶向miR-409-3p促进非小细胞肺癌细胞的侵袭性[13]。本研究结果显示，过表达PSMA3-AS1可加速肺癌细胞周期进程，促进肺癌细胞迁移，并阻碍肺癌细胞凋亡，提示PSMA3-AS1对肺癌的发展起促进作用，其有可能成为肺癌治疗的分子靶点；黑加仑提取物可剂量依赖性地降低肺癌细胞中PSMA3-AS1的表达，而过表达PSMA3-AS1逆转了黑加仑提取物对肺癌细胞的细胞周期、迁移及凋亡的影响。提示黑加仑提取物可能通过下调PSMA3-AS1表达来抑制肺癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述，黑加仑提取物可有效阻滞肺癌细胞周期进程，抑制细胞迁移，并促进细胞凋亡，其可能通过下调PSMA3-AS1表达发挥作用。本组将进一步探究黑加仑提取物抗肺癌的作用机制，并通过裸鼠移植瘤实验验证其作用。