星状神经节阻滞对体外循环大鼠海马神经元凋亡的影响*

刘国锋，毛 琦，李 帅，张炳东

（广西医科大学第一附属医院导管手术麻醉室，南宁 530021）

体外循环（cardiopulmonary bypass，CPB）是利用一系列特殊人工装置将回心静脉血引流到体外，经人工方法进行气体交换，调节温度和过滤后，输回体内动脉系统的生命支持技术，为心内直视手术提供重要保障。然而，由CPB术后脑损伤导致的神经系统并发症发生率居高不下，其机制尚未清楚，可能与炎症反应、缺血/再灌注、微循环障碍等有关[1-2]。星状神经节阻滞（stellate ganglion block，SGB）是将局部麻醉药注射到含有星状神经节的结缔组织内，可逆性地阻断其节前及节后纤维的兴奋传递而发生作用，临床上常用于治疗各种疼痛、创伤后应激障碍（PTSD）、缺血性脑损伤等引起的功能障碍[3-4]。近年来本课题组及其他学者研究发现，SGB 对CPB 术后引起的认知功能障碍有一定的保护作用，其机制可能涉及细胞凋亡和炎症损伤[5-6]。颅脑局部缺血缺氧易引起细胞凋亡，是引起认知功能障碍的潜在分子机制之一[7]，而细胞凋亡涉及的通路包括死亡受体途径和线粒体途径。本研究将SGB应用于大鼠CPB脑损伤模型中，探讨细胞凋亡可能的途径及机制，为临床上SGB应用于CPB脑损伤的治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 苏木精—伊红（HE）染色试剂盒（武汉博士德生物有限公司）；TUNEL 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；通用型SP 免疫组化试剂盒；DAB 显色试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；Bax、细胞色素c（Cyt-c）、Caspase-3、β-actin抗体（英国Abcam公司）。

1.2 实验动物和分组 健康清洁级成年雄性SD大鼠40 只，体重300～320 g，由广西医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（桂）2014-0002。将大鼠随机分为4组：假手术组（S组）、SGB 组、CPB 组、SGB+CPB 组，每组10 只。术前均禁食8 h，可自由饮水。本研究所有动物实验均符合伦理委员会要求。

1.3 SGB 和CPB[8]S 组和CPB 组腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg/kg）进行深麻醉，S 组只做动静脉穿刺。CPB组仰卧位固定于小动物手术台上，行气管插管，用16G动静脉留置针代替气管导管连接小动物呼吸机；迅速分离大鼠双下肢股动脉和右侧颈静脉，测左侧股动脉的平均动脉压；从右侧颈静脉引流静脉血，经过小动物膜式氧合器置换成动脉血，再经右侧股动脉灌注重回大鼠体内，完成CPB并维持2 h。静脉注射肝素400 IU/kg，当激活全血凝固时间超过480 s 时开始转流。CPB 总预充液体约为12 mL，包括5%碳酸氢钠溶液1 mL、肝素水1 mL（125 U/mL）、乳酸林格溶液4 mL、羟乙基淀粉溶液6 mL，晶体/胶体比例约1∶1。

SGB 组和SGB+CPB 组腹腔注射1%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行浅麻醉，从大鼠第7 颈椎棘突进针注射0.25%布比卡因0.2 mL，当大鼠出现明显的霍纳综合征则表示SGB 模型制备成功。再腹腔注射1%戊巴比妥钠（10 mg/kg）腹腔注射进行深麻醉，SGB+CPB组建立CPB模型。在CPB期间采用自然降温和白炽灯照射复温的方式控制温度，S 组和SGB 组大鼠体温维持在36 ℃及以上，CPB 组和SGB+CPB组体温维持在34 ℃及以上。

1.4 标本采集 各组大鼠在CPB 2 h 后，迅速断头取脑，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分用预冷生理盐水冲洗干净，冰上迅速分离海马组织，分装冻存于-80 ℃冰箱备用。

1.5 海马组织HE 染色 取经4%多聚甲醛固定24 h的脑组织，石蜡包埋，切片（5 μm厚），梯度乙醇脱水，二甲苯脱腊及梯度乙醇复水后，行HE 染色，用中性树胶封片。每张切片随机选取5 个视野，显微镜下观察海马组织病理形态学改变，拍照。

1.6 TUNEL法检测海马组织细胞凋亡 制备脑组织切片，脱腊、梯度乙醇水化、3%H2O2的甲醇溶液处理后，滴加蛋白酶K 工作液、TUNEL 反应混合液和DAB 底物染色，经苏木精复染后梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜下观察。TUNEL 阳性细胞呈棕褐色，即凋亡细胞，正常细胞呈蓝紫色。每张切片随机选取5 个视野，计算凋亡指数，即TUNEL阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.7 免疫组化检测海马组织Bax 蛋白表达 参照试剂盒说明书步骤，梯度乙醇脱水、抗原修复、山羊血清封闭，滴加兔抗大鼠Bax多克隆抗体（1∶800），4 ℃孵育过夜；次日滴加山羊抗兔IgG（二抗），DAB显色。每张切片随机选择5个视野计数，用Image J软件对免疫组化阳性结果进行半定量分析。

1.8 Western blotting法检测海马组织Cty-C和Caspase-3 蛋白表达 取大鼠海马组织于离心管中，加入预冷的组织裂解液，冰浴匀浆，离心，取上清，即为蛋白样本；BCA 法检测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳分离蛋白；湿转法将蛋白转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗Cty-C、Caspase-3 和βactin 稀释液（均1∶1 000）4 ℃孵育过夜；洗膜，加入荧光二抗（1∶1 000）室温下避光孵育1 h；洗膜，Oddsey扫描仪分析灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin 条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析数据，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SGB 可减轻由CPB 引起的大鼠海马神经元损伤 显微镜下可见S 组和SGB 组海马CA3 区细胞形态正常，排列大多整齐，边界清晰，细胞膜完整，细胞核明显，神经元基本结构均正常；CPB 组和SGB+CPB 组海马神经元可见明显损伤，胞体肿胀透明，弥漫性空泡变性，细胞间排列疏松紊乱，胞核与胞膜之间的界限不清，细胞核溶解消失，部分出现核固缩；与CPB组比较，SGB+CPB组损伤程度减轻，胞体肿胀透明明显缓解，神经元空泡变性的数量显著减少，见图1。

图1 大鼠海马组织HE染色图（×20）

2.2 SGB可减少由CPB引起的海马神经元凋亡 S 组和SGB 组极少见凋亡细胞。CPB 组和SGB+CPB组可见大量凋亡细胞，呈棕褐色。与S组（6.12±1.25）%比较，CPB 组（34.03±3.03）%和SGB+CPB 组（25.38±4.37）%凋亡指数明显升高（P＜0.01），而SGB 组（6.15±0.96）%无明显差异（P＞0.05）；与CPB组比较，SGB+CPB组凋亡指数明显降低（P＜0.05），见图2。

图2 TUNEL法检测海马组织细胞凋亡（×400）

2.3 SGB 可下调CPB 大鼠海马神经元Bax 蛋白表达 S组和SGB组可见少量浅棕色Bax阳性表达蛋白，CPB 组和SGB+CPB 组可见大量棕褐色Bax 阳性表达蛋白，见图3。与S 组（0.24±0.04）比较，CPB组（0.49±0.08）、SGB+CPB组（0.36±0.05）Bax蛋白表达量明显升高（P＜0.05），而SGB 组（0.27±0.05）无明显差异（P＞0.05）；与CPB 组比较，SGB+CPB 组Bax蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。

图3 大鼠海马组织Bax蛋白表达（SP法，×400）

2.4 SGB可下调CPB大鼠海马神经元Cyt-c和Caspase-3 蛋白表达 与S 组比较，CPB 组、SGB+CPB组海马神经元Cyt-c和Caspase-3蛋白表达量明显升高（P＜0.01），而SGB 组无明显差异（P＞0.05）；与CPB组比较，SGB+CPB组Cyt-c和Caspase-3蛋白表达量明显降低（P＜0.05），见图4。

图4 4组大鼠海马组织Cyt-c和Caspase-3蛋白表达比较

3 讨论

CPB技术对于大多数心脏手术是不可缺少的，但在为心血管外科手术提供安全可靠保障的同时，由其引起的不良反应也日渐增多。在心血管手术中，一旦建立CPB 技术，人体将不可避免受到来自多方面损害，包括血液与心肺机和各种管道异物表面接触、体内肠道菌群发生移位引起败血症、器官缺血再灌注引起信号分子级联反应、抗凝物质的使用激活全身补体系统等[9]。CPB术后的神经系统并发症是由CPB后脑损伤导致的常见问题，并发症的主要表现包括认知功能障碍、短暂性脑缺血、卒中及精神异常等。脑损伤的机制至今不明确，缺血性损害、炎症反应、氧化应激和凋亡可能是其主要原因[10-11]。

细胞凋亡又称“程序性细胞死亡”，它的本质是保持组织器官细胞的恒定生长平衡，清除衰老或异常折叠的细胞。机体正常生理机能情况下如果受到来自细胞内外的异常刺激，例如缺血、缺氧、内毒素、DNA 损伤等，都会诱导细胞凋亡的发生。而异常调控的细胞凋亡多与疾病的发生发展有关，例如阿尔茨海默病、中风、癌症等。细胞凋亡的调控是一个复杂的过程，文献综述将经典的细胞凋亡途径分为外在凋亡途径（又叫死亡受体途径）和内在凋亡途径（又叫线粒体途径）[12]。在大脑损伤疾病中，缺氧缺血激活凋亡的程序基因是造成神经元凋亡的主要原因，而缺氧缺血是CPB引起的常见不良反应之一[12]。多个动物试验研究发现，CPB 可诱发大鼠脑组织损伤，海马神经元凋亡增多，凋亡指数增加[13-14]。海马是CPB 术后损伤较为严重的部位之一，其主要功能与认知和学习记忆能力有关，说明CPB 术后引起的认知功能障碍与海马密切有关[5]。本研究结果显示，CPB 组海马CA3 区细胞损伤明显，HE染色显示海马神经元肿胀透明，出现弥漫性空泡变性；CPB 组海马神经元凋亡指数明显高于S组，与上述研究结果相符。

脑缺血后神经元ATP耗竭，由受体介导的死亡信号及促凋亡家族蛋白Bax 可引起线粒体膜孔开放，引起线粒体肿胀、损伤。Caspase-3 与细胞凋亡关系密切，是细胞凋亡的主要执行者，激活以后可作用于相应底物，引起细胞凋亡级联反应[15]。研究表明，大鼠CPB术后脑组织内Bax和Caspase-3的表达显著上升[14]。体外试验发现采用缺氧/复氧诱导PC12 细胞，促凋亡蛋白Bax 和Caspase-3 的表达显著上升[16]。本研究结果显示，与S组比较，CPB组海马神经元促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表达显著上调。Cyt-c 释放是线粒体凋亡途径的标志事件。正常生理状态下Cyt-c 不能进入细胞，在缺氧/缺血等病理状态下，细胞膜通透性增加，Cyt-c 可进入细胞和线粒体发挥作用[17]。本研究发现，CPB 组海马神经元Cyt-c 表达显著上调，说明凋亡的线粒体途径可能是CPB术后导致的认知功能障碍的机制之一。

SGB 采用局部阻滞颈部交感神经节治疗其支配区域疼痛的经典方法。近年研究发现，SGB能增加脑血液供应，改善氧代谢，对缺血性脑损伤产生保护作用[18]。有临床研究发现，SGB 可以改善老年冠状动脉旁路移植术后患者的认知功能[19]。SGB可减低家兔全脑缺血再灌注后海马区Bax 的表达[20]，还可减轻急性缺氧诱发的大鼠脑损伤，神经元凋亡减少，Bax 表达下调[21]。本课题组前期试验发现，SGB 能改善CPB 术后大鼠脑组织灌注以及缓解认知功能障碍[5,8]。本研究中，与CPB 组比较，SGB+CPB组大鼠海马神经元凋亡数明显减少，Cyt-c、Bax和Caspase-3蛋白表达量明显降低。说明SGB可明显减轻由CPB术后导致的海马神经元损伤，其机制可能是调控凋亡的线粒体途径。

综上，SGB可通过调节海马神经元凋亡的线粒体途径，缓解CPB 导致的神经元凋亡，改善大鼠术后的认知能力，这将为今后临床改善患者CPB术后认知功能障碍提供新的思路和方法。