银杏双黄酮介导AMPK/COX-2通路对黑色素瘤细胞凋亡的影响*

杨丰侨，柏 磊，盛玉清，季 娟，马葵芬

（1.浙江大学附属第一医院，杭州 311100；2.江苏省镇江市第一人民医院，镇江 212000；3.南京医科大学药理学系江苏省神经退行性疾病重点实验室，南京 210000）

随着我国工业化的迅猛发展，臭氧层的损害和严重恶化增加了人类紫外线受到暴露的危险，我国的黑色素瘤发病率呈现出快速攀升和增长的态势[1-2]。黑色素瘤具有高转移率、侵袭性强、高死亡率及对化疗药物敏感性低，且极易产生耐药性等特性[3]。据报道，肿瘤细胞对凋亡的抵抗性可有效降低细胞对化疗药物的敏感性[4]，凋亡及其调节因子是探究恶性黑色素瘤耐药的重要机制。手术治疗是最有效的治疗黑色素瘤的方案，但由于黑色素瘤发病常隐袭且早期具有高转移率，故不能及时手术治疗[5]。目前临床上使用的大部分治疗药物，如维罗非尼[6]、曲美替尼[7]、替莫唑胺[8-9]等，均有一定毒副作用，易引起致癌基因突变，增强患者耐药性。故寻找毒副作用小，且疗效好的抗肿瘤药物至关重要。随着我国中医药的进步，越来越多的科学研究也证明，传统的中药活性成分，如芍药苷，可显著提高其对放疗的敏感性，在肿瘤的治疗过程中具有独特的效果[10]，这也为黑色素瘤的治疗开辟了一种新的思路。银杏双黄酮（Ginkgo biloba biflavones，GBB）是从银杏叶中提纯的化合物，具有抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，是一种极具开发潜力的物质[11]。已有研究显示，单磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphate activated protein kinase，AMPK）/环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）通路在恶性肿瘤的发生发展中扮演着重要的角色[12]，如吲哚类化合物GY3 可基于AMPK/COX-2通路诱导乳腺癌细胞凋亡[13]。因此，本研究通过研究GBB 对人黑色素瘤A875 细胞凋亡的影响，进一步探究AMPK/COX-2通路在此过程中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人黑色瘤细胞株A375、A875、WM115、MV3以及SK-Mel-28均购自美国ATCC中心；胎牛血清购自美国GEMINI（货号：900-108）；0.25% 胰蛋白酶购自美国Hyclone（货号：SH30042.01B）；DMEM 培养基购自上海HAKATA（货号：A19008）；GBB购自安徽仕诺达（货号：SND-1458，纯度＞98%）；Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京BIOSIC（货号：CC2210-20T）；AMPK抑制剂Compound C购自美国Merck（货号：171260-1MG）；兔抗人p-AMPK、AMPK购自abcam公司（货号依次为：ab133448、ab32047）；兔抗人p-ACC、COX-2、β-肌动蛋白（β-actin）购自北京Bioss（货号依次为：bs-0061R-2、bs-10411R-2、bs-0061R-2）；兔抗人ACC 购自上海谷研（货号：GOY-K3691 A）；HRP 标记山羊抗兔IgG 购自中国万类生物（货号：WLA023）；聚偏氟乙烯膜（PVDF 膜）购自美国Millipore（货号：IPVH00010）；ECL 化学发光剂购自上海碧云天（货号：P0018FM）。

1.2 细胞培养 人黑色瘤细胞株在DMEM培养基（含10%胎牛血清）中于37 ℃培养箱培养（5%CO2，95%湿度），当细胞生长超过80%培养瓶面积后，进行传代培养，添加0.25%胰蛋白酶消化液消化，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞回缩变小、变圆后添加适量的培养基终止消化，再轻吹打细胞，使细胞悬浮，将悬浮液转移至新的15 mL离心管中，离心1 000 r/min 5 min，去上清，加入12 mL 培养基重悬细胞，后按照1∶2的比例分瓶传代培养。

1.3 细胞分组及处理 取处于对数期生长的人黑色素瘤细胞，使用PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞于离心管中，离心后，去上清后，加入新培养基，轻轻吹打至悬浮，使细胞浓度至105个/mL 后于6 孔板中继续培养24 h，随后换新的培养基，依次添加0 μmol/L、50 μmol/L、100μmol/L、200 μmol/L 的GBB 处理，每个处理设置6 个重复，然后置于培养箱中培养24 h。再次培养细胞，依次添加0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L GBB 以及10 μmol/L Compound C[14]，200 μmol/L GBB+10 μmol/L Compound C，每个处理设置6个重复，随后置于培养箱中培养24 h。

1.4 CCK-8 法检测细胞活力 收集对数期生长细胞，将对数期生长的各个株系的人黑色素瘤细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞培养24 h后添加胰蛋白酶消化终止培养，后加入适量CCK-8溶液于37 ℃避光孵育2 h，使用酶标仪测定各孔细胞在490 nm波长处的光密度值（OD）。细胞增殖活力（100%）=OD实验组/OD对照组×100%。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡24 h后取出6孔板，添加胰蛋白酶消化，调节细胞至悬浮，收集GBB处理下各组细胞，离心弃上清，提前预冷PBS清洗3次后于各组各个离心管中依次加入Binding Buffer，使细胞悬浮，分别添加5 μL Annexin V-FITC 混匀后、再添加10 μL PI 溶液，轻轻混匀，25 ℃避光15 min。流式细胞仪检测分析（Annexin V-FITC检测凋亡早期细胞，Annexin V-FITC+PI 检测凋亡中晚期细胞）不同浓度GBB 对A875 细胞凋亡率的影响。

1.6 Western blotting 法检测细胞AMPK/COX-2 通路 相关蛋白表达24 h后取出6孔板，去上清，添加提前预冷的PBS 清洗3 次后，添加蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，充分裂解细胞，30 min后收集细胞，低温离心10 min，吸取上清至新的离心管中，使用酶标仪测定蛋白浓度，蛋白定量后，加入Loding buffer混合，95 ℃煮沸变性。取25 μg变性后蛋白样品上样，电泳后用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，使用5%脱脂牛奶封闭2 h 后，将PVDF 膜置于孵育盒中，依次适量添加一抗（p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2、β-actin，稀释比例为1∶500），低温孵育过夜，隔天使用TBST 漂洗3 次，添加二抗（按1∶5 000 稀释）孵育，水平摇床孵育1.5 h，使用TBST漂洗3次，添加ECL 混合发光液曝光显影。图像使用Image J分析灰度值。

1.7 统计学方法 采用统计软件SPSS25.0 处理实验数据，计量资料以均数±标准差（）表示，单因素方差进行显著性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GBB对不同人黑色素瘤细胞活力的影响与 0 μmol/L GBB 相比，不同浓度GBB（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）作用24 h 后，人黑色素瘤细胞的增殖率明显降低，其中以A875 细胞增殖率受GBB影响变化最大，增殖率最低，故选择A875作为后期实验研究对象，见表1。

表1 GBB对不同人黑色素瘤细胞增殖率的影响 %，，n=10

表1 GBB对不同人黑色素瘤细胞增殖率的影响 %，，n=10

与0 μmol/L GBB比较，aP＜0.05；与50 μmol/L GBB比较，bP＜0.05；与100 μmol/L GBB比较，cP＜0.05。

2.2 GBB对人黑色素瘤A875细胞生长形态的影响 倒置显微镜下观察人黑色素瘤A875 细胞的生长形态，发现正常细胞状态良好，贴壁、紧密、单层生长，且大小均匀，具有很好的折光性。在不同浓度GBB（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）作用24 h 后，可明显看出，随着GBB 浓度的增高，A875细胞明显减少，细胞形态回缩变小、变圆、变亮，细胞间接触消失，部分细胞脱落裂解为碎片状，悬浮细胞越来越多，且折光性也随着减弱，呈现典型的细胞凋亡现象，见图1。

图1 不同浓度GBB作用下人黑色素瘤A875细胞形态（×200）

2.3 GBB对人黑色素瘤A875细胞凋亡的影响 不同浓度GBB（50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L）作用A875 细胞24 h 后，细胞凋亡率随着GBB 浓度的增加而升高，且均明显高于0 μmol/L GBB组（P＜0.05），见图2。

图2 流式细胞仪检测不同浓度GBB作用下的细胞凋亡率

2.4 不同浓度GBB 对人黑色素瘤A875 细胞中p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表达的影响 p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK 比值随着GBB浓度的增加而升高（P＜0.05），COX-2蛋白表达水平则随着GBB浓度的增加而降低（P＜0.05），见图3。

图3 不同浓度GBB对p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表达的影响

2.5 GBB 联合Compound C 对人黑色素瘤A875 细胞中p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表达的影响 与200 μmol/L GBB 相比，Compound C处理细胞中p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK比值明显降低（P＜0.05），COX-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；200 μmol/L GBB+Compound C 处理细胞中p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK 比值降低明显（P＜0.05），COX-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），见图4。

图4 GBB联合Compound C对p-ACC、ACC、p-AMPK、AMPK、COX-2蛋白表达的影响

3 讨论

目前，随着我国中医药事业持续发展，更多具有中药作用的天然植物提取物受到研究学者的关注，中医药不仅可减轻患者的毒副作用，且影响肿瘤细胞的增殖、凋亡等过程[10]。GBB是银杏叶中含量较低，极难提取的一种化合物，其部分生物活性优于单黄酮，是一种极具潜力的双黄酮类化合物。有研究发现，穗花杉双黄酮可通过调节CIP2A表达进而达到抑制肺腺癌细胞生长，促进凋亡的目的[15]。GBB 协同白藜芦醇共同作用于血管内皮生长因子，抑制内皮细胞的增殖、迁移，同时，进而影响肿瘤微血管的生成[16]。本研究通过体外培养人黑色素瘤细胞A875发现，随着GBB浓度的不断增加，A875 细胞呈现明显的细胞凋亡表现，如细胞回缩、数量减少、悬浮细胞增多、折光性变差等多个细胞形态学变化，以上表明GBB可以促进细胞凋亡。随后，为了更进一步验证GBB 是否具有诱导A875 细胞凋亡的作用，采用流式细胞仪检测不同浓度GBB作用下的A875 细胞凋亡率发现，A876 细胞早期凋亡率和中晚期凋亡率随着GBB 浓度的提高呈现上升的趋势，由图3 可更直观的看出人黑色素瘤细胞A875 凋亡率随着GBB 浓度的提高而提高，且呈现剂量依赖性。以上实验表明，GBB 具有促进A875细胞凋亡的作用，但其相关机制尚不明晰，为了进一步探索GBB诱导黑色素瘤细胞凋亡的作用机制，本研究又进行了后续实验。

AMPK/COX-2通路可参与调控肿瘤发生发展，AMPK 是调控细胞能量代谢的关键因子，可促进ATP的产生以及能量的代谢过程[17]。AMPK可抑制肿瘤代谢，是肿瘤预防及治疗的关键位点，可以通过影响下游靶蛋白mTOR、COX-2及ACC等表达调控肿瘤的发生发展过程[18]。有研究发现，姜黄素可通过AMPK/COX-2 信号通路参与结肠癌细胞的增殖和凋亡[19]。吲哚类化合物GY3 可通过激活AMPK/COX-2 信号通路，进而抑制人乳腺癌细胞MCF-7 增殖，促进其凋亡[13]。COX-2 属于一种诱导酶，当细胞受到生长因子、炎性介质、促癌剂等刺激时，其表达会有明显的上升，已有多项研究证明COX-2可在多种肿瘤组织中高表达，可参与肿瘤的发生发展过程，与肿瘤的预后密切相关[20]。有研究表明，COX-2 与抗肿瘤凋亡过程密切相关，在乳腺癌细胞中高表达，可明显提高抗凋亡基因Bcl-2 水平，激活ATP介导通路或NF-κB通路进而抑制细胞凋亡，抑制CytC 释放减少细胞凋亡，COX-2 可作为多种肿瘤治疗靶点[21]。ACC 是AMPK 通路的关键靶蛋白，p-ACC可作为此通路激活的最佳指标。已有研究证实，p-ACC 可在甲状腺乳头癌中高表达，且参与颈部淋巴结转移过程，激活AMPK-ACC 通路促进了甲状腺乳头癌的发生和转移[22]。本研究结果显示，与0 μmol/L GBB 相比，添加不同浓度的GBB 可提高ACC、AMPK 磷酸化蛋白表达，降低COX-2 蛋白表达，且呈现一定的剂量依赖性，提示GBB可能通过激活AMPK，抑制COX-2的表达促进肿瘤细胞的凋亡，达到抗肿瘤的目的。随后为了更深入的探究AMPK/COX-2通路调控黑色素瘤A875细胞凋亡机制，本研究添加AMPK 抑制剂Compound C 培养A875 细 胞24 h 发现，与200 μmol/L GBB相比，200 μmol/L GBB+Compound C处理细胞中p-ACC/ACC、p-AMPK/AMPK 比值显著降低，COX-2蛋白表达显著提高，说明当GBB激活AMPK通路被Compound C 抑制时，改变了GBB 对COX-2表达的调控作用，验证了COX-2是AMPK的靶标蛋白，进一步体现了AMPK/COX-2 通路在GBB 调控黑色素瘤细胞凋亡过程中的作用。

综上所述，GBB可通过激活AMPK信号进而抑制COX-2的表达，诱导人黑色素瘤A875细胞凋亡，本研究为GBB 运用于黑色素瘤的治疗提供了理论依据。本研究仅是初步探讨GBB 诱导黑色素瘤细胞凋亡机制，并未深入研究GBB对化疗的敏感性作用。此外，细胞信号传导是一个复杂的机制，GBB抑制A875 细胞COX-2 表达进而诱导A875 细胞凋亡是否还有其他通路的参与，有待后续进行更深入的探究。