银杏叶提取物注射液对糖尿病足溃疡模型大鼠创面恢复的作用及机制研究*

何丰来，肖 聪，龙能吉，刘利娟

（四川省绵阳市第三人民医院 四川省精神卫生中心骨科，绵阳 621000）

糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer，DFU）是糖尿病患者常见的严重并发症，约有四分之一的糖尿病患者会并发糖尿病足。DFU 增加了糖尿病患者下肢截肢和死亡风险[1]，严重影响患者的生活质量，给社会和患者家庭带来巨大的经济负担[2-3]。如何促进DFU 创面愈合，避免伤口反复感染，从而降低局部组织缺血坏死甚至致残，是目前亟待解决的医学难题。

银杏叶提取物注射液具有化淤阻、活气血、通脉络等功效，其主要成分为黄酮苷、银杏叶多糖、银杏叶黄酮，还有部分银杏苦内脂，银杏内脂A、B、C等活性成分[4-5]，具有清除自由基、拮抗血小板活化因子及影响神经介质等作用[6]，在治疗冠心病、心绞痛、脑血管痉挛方面有着广泛的应用。有研究显示，Wnt/β-catenin 信号通路的抑制是糖尿病足发生的重要机制[7]。在骨质疏松、肺癌血管生成以及神经系统疾病等方面，银杏叶提取物对Wnt/β-catenin通路有调控作用[8-10]，但其对糖尿病足的作用鲜少报道。本研究旨在观察银杏叶提取物注射液对DFU大鼠及普通溃疡大鼠创面愈合的作用及其机制，并比较不同注射方式的效果，为其作为新药研发和临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 48 只健康雄性SD 大鼠，体重150～200 g，由四川大学华西医院科技园区科研基地提供，动物生产许可证号：SCXK（川）2020-030，动物使用许可证号：SYXK（川）2018-119。所有动物饲养于温度21～25 ℃，湿度40%～60%，12 h/12 h明暗交替的清洁级动物房内，自由摄食、饮水。实验严格遵守动物实验中的3R原则。

1.2 药物和主要试剂 银杏叶提取物注射液购自悦康药业集团有限公司。链脲佐菌素（STZ）购自索莱宝公司。肿瘤坏死因子（TNF）-α、白细胞介素（IL）-6、IL-8、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购于美国Abcam 公司。兔抗鼠Wnt1 多克隆抗体、兔抗鼠Wnt3α多克隆抗体、兔抗鼠β-catenin单克隆抗体、兔抗鼠单克隆CD34 抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗均购于美国Abcam公司。

1.3 实验分组和给药 将48只大鼠随机分为6组，分别为普通溃疡组、普通溃疡+术前术后注射组、普通溃疡+术后注射组、DFU 组、DFU+术前术后注射组、DFU+术后注射组，每组8只。DFU 组、DFU+术前术后注射组、DFU+术后注射组建立DFU 大鼠模型，普通溃疡组、普通溃疡+术前术后注射组、普通溃疡+术后注射组不进行糖尿病诱导，仅在相同位置行皮肤切除制作溃疡创面。

普通溃疡组和DFU 组创面基底部不注射银杏叶提取物注射液，仅给予等量生理盐水。普通溃疡/DFU+术前术后注射组从术前2 d开始，在手术创面基底部局部注射银杏叶提取物注射液90µL[11]，1次/d，持续注射至术后21 d；普通溃疡/DFU+术后注射组术后在手术创面基底部注射银杏叶提取物注射液90µL，1次/d，持续注射21 d。

1.4 DFU 大鼠模型的建立 采用高糖高脂饲料喂养4 周，禁食24 h 后腹腔注射40 mg/kg 以柠檬酸缓冲液配制的1%STZ溶液，隔天注射，共注射3次，建立糖尿病模型。血糖高于16.7 mmol/L，并出现多饮多尿，背毛污秽，垫料潮湿，表示糖尿病模型制备成功。糖尿病模型制备后各组大鼠均改为普通饲料饲养。成模2周后，用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，于足背部消毒后，除毛。生理盐水清洗后暴露皮肤，术区碘伏消毒，75%乙醇脱碘。使用直径8 mm的活检穿孔器标记，以手术剪沿标记制作全层皮肤开放性缺损创面，面积约为1.0 cm×1.0 cm[12]。彻底止血、消毒，全程保持自然暴露[13]。普通溃疡组大鼠不进行糖尿病诱导，仅在相同位置行皮肤损伤。

1.5 创面形态观察及愈合率检测 记录各组术后1周、2周、3周大鼠创面恢复情况，以完全被上皮覆盖作为创面愈合依据。采用Image-Plus 6.0 图像分析软件测定溃疡创面面积，每周计算愈合率。创面愈合率=[（原始创面面积-未愈合创面面积）/原始创面面积]×100%。

1.6 免疫组化计数组织创面微血管密度（MVD）[14]创口形成21 d 后，用4%戊巴比妥钠麻醉后处死大鼠，取创面边缘组织标本，中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水后，3%H2O2浸泡10 min，清水洗2次，柠檬酸缓冲液煮沸2次；缓冲液清洗2次后山羊血清封闭，加入鼠抗单克隆CD34 抗体，4 ℃孵育过夜；加入HRP标记的山羊抗兔二抗，显色剂显色，苏木精中复染。脱水后二甲苯浸泡封片晾干，显微镜下观察CD34表达情况，拍照。用CD34蛋白作为标记计数MVD，反映新血管生成程度。CD34标记MVD的判定方法：20倍（物镜）视野下计数血管直径＜20 μm，与周围细胞分界清楚即为一个新生血管，MVD 为每个视野下的血管数。

1.7 创面组织TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD检测 创口形成21 d 后，将大鼠麻醉后处死，取创面组织样本称重，4 ℃下研磨制成5%组织匀浆，冰上静置10 min 后，3 500 r/min 离心15 min，吸取上清液，采用ELISA 法检测创面组织中TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD含量。

1.8 Western blotting 法检测Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白表达 创口形成21 d后处死动物，取溃疡面伤口组织。使用RIPA裂解液在冰上提取组织总蛋白，蛋白定量；10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h；TBST洗膜5 min，重复3 次，分别加入一抗Wnt1、Wnt3a、β-catenin及β-actin（均1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5 min，重复3 次；加入相应HRP 标记二抗（1∶1 000），室温孵育1 h。TBST 洗膜5 min，重复3 次，ECL发光试剂盒发光显影，凝胶成像系统成像，Image J 软件计算条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠创面愈合率比较 随着时间延长，各组大鼠创面愈合率均升高。术后1 周、2 周，与普通溃疡组/DFU组比较，普通溃疡/DFU+术前术后注射组大鼠创面愈合率明显升高（均P＜0.05）；术后1周、3 周，DFU 组大鼠创面愈合率明显低于普通溃疡组（P＜0.05）；术后2 周，与DFU+术后注射组比较，DFU+术前术后注射组大鼠创面愈合率明显升高（P＜0.05）；术后3周，除DFU组外，其他各组大鼠创面愈合率均为99%以上，见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率比较 %，

表1 各组大鼠创面愈合率比较 %，

与普通溃疡组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与DFU组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与DFU+术后注射组比较，△P＜0.05。

2.2 各组大鼠创面组织MVD比较 大鼠创面组织CD34免疫组化染色结果显示：与普通溃疡组比较，普通溃疡+术前术后注射组CD34阳性表达升高，即MVD 增加，DFU 组和DFU+术后注射组CD34 阳性表达降低，即MVD 减少（均P＜0.05）；与DFU 组比较，DFU+术前术后注射组CD34 阳性表达升高，即MVD 增加（P＜0.01），与普通溃疡/DFU+术后注射组比较，普通溃疡/DFU+术前术后注射组CD34 阳性表达升高，即MVD增加（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠创面组织CD34染色情况（×400）及创面组织MVD比较

2.3 各组大鼠创面组织TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD 水平比较 普通溃疡组、普通溃疡+术前术后注射组、普通溃疡+术后注射组创面组织TNF-α、IL-6、IL-8、MDA、SOD水平比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与普通溃疡组比较，DFU组TNF-α、IL-6、IL-8、MDA 水平升高，SOD 水平降低（P＜0.01）；与DFU组比较，DFU+术前术后注射组创面SOD水平升高，TNF-α、IL-6、IL-8、MDA 水平降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠创面MDA、SOD水平比较

表2 各组大鼠创面MDA、SOD水平比较

与普通溃疡组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与DFU组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

2.4 各组大鼠创面Wnt/β-catenin 通路蛋白表达比较 创面形成后21 d，与普通溃疡组比较，普通溃疡+术前术后注射组Wnt1蛋白表达量升高，DFU组Wnt1、Wnt3α和β-catenin蛋白表达量降低，DFU+术后注射组Wnt1和β-catenin蛋白表达量降低（均P＜0.05）；与DFU组比较，DFU+术前术后注射组Wnt1、Wnt3a和β-catenin蛋白表达量升高（P＜0.05），见图2。

图2 各组大鼠创面Wnt/β-catenin通路蛋白表达量比较

3 讨论

由于周围神经病变导致感觉减退以及肢体血管病变缺血，导致糖尿病患者局部感染形成糖尿病足。治疗方案主要包括清创及促进愈合[15-16]。糖尿病患者中，90%属于2型糖尿病[17]，因此，本研究采用高脂饲料喂养结合STZ诱导的方法，建立了更接近于临床的2型糖尿病大鼠模型。糖尿病患者皮肤结构发生病理性改变，创伤发生后，持续性炎性因子浸润导致细胞外基质沉积。本研究采用银杏叶提取物注射液对创面组织进行干预，发现普通溃疡组大鼠创面愈合率高于DFU组，且术前术后注射组大鼠创口愈合率高于术后注射组大鼠。在创口形成后2周内，DFU+术前术后注射组大鼠创面愈合率显著低于DFU 组，但在术后3 周时，其创口愈合率接近100%。说明术前及术后注射对于DFU创口的治疗效果达到正常组织水平。

愈合创面受损还与血管生成减少和异常炎症反应有关[18-19]。CD34 蛋白广泛分布于毛细血管内皮细胞，在成熟血管内皮中的表达很低，因此，采用CD34 作为表面标记来计数MVD，具有较高的特异性、敏感性和可重复性，可反映新血管的生成程度[20]。本研究采用免疫组化方法检测大鼠创面CD34蛋白表达，发现DFU组大鼠创面组织CD34蛋白表达量显著低于普通溃疡组（P＜0.05），这与DFU 大鼠溃疡部位血管生成减少的研究[21]结果一致。且DFU大鼠术前、术后均给予银杏叶提取物注射液后，其CD34 蛋白表达高于仅术后注射的大鼠及未注射的大鼠。表明术前及术后注射银杏叶提取物注射液可增加DFU大鼠创面微血管生成，从而促进创口愈合。

IL-6和IL-8是人体重要的免疫细胞因子，TNFα 是由单核巨噬细胞分泌的促炎因子[22]，与机体炎症和免疫反应密切相关[23-24]。本研究中，DFU 组大鼠创面组织IL-6、IL-8 和TNF-α 水平显著高于普通溃疡组（P＜0.05），而术前、术后注射银杏叶提取物注射液处理后，DFU 大鼠创面组织TNF-α、IL-6 和IL-8含量降低，但仍高于普通溃疡组，提示糖尿病足大鼠创面炎症反应未能达到健康大鼠水平，但银杏叶提取物注射液局部注射可以抑制糖尿病足大鼠创面组织炎症反应，控制伤口感染，从而可能减少糖尿病足截肢的发生[25]。

2 型糖尿病的发生和发展涉及到多种机制[26]。除了糖脂代谢失调以外，免疫损伤和氧化应激也是2型糖尿病周围神经病变的原因之一[27]。MDA是脂质过氧化产物，其水平升高提示体内存在活性氧聚集，机体处于氧化应激状态，而SOD 是体内抵御氧化应激重要的抗氧化剂，与机体的抗氧化能力密切相关[28]。本研究发现，DFU 组大鼠创面组织MDA水平显著高于普通溃疡组大鼠，SOD水平显著低于普通溃疡组大鼠；且术前、术后给予银杏叶提取物注射液后，大鼠创面组织SOD 水平显著升高（P＜0.05）。提示DFU 大鼠创面组织应激水平高于普通溃疡大鼠，银杏叶提取物可显著提高DFU大鼠的抗氧化能力，改善创面组织的愈合。

Wnt/β-catenin 通路是调控细胞增殖、分化及凋亡经典的信号通路之一。该通路的经典上游分子Wnt1 激活后能够使GSK-3β 发生磷酸化，而磷酸化的GSK-3β 可使β-catenin 的降解减弱，进而调节多种基因的表达并促进细胞增殖[29]。糖尿病足患者体内的高糖、感染等因素使得Wnt通路的信号转导受阻，进而抑制创面内细胞增殖，不利于创面的修复[30]。本研究结果显示，DFU 组大鼠创面组织Wnt1、Wnt3a 和β-catenin 显著低于普通溃疡组，术前、术后银杏叶提取物注射液治疗后，DFU 大鼠创面组织Wnt1和Wnt3a表达明显升高（P＜0.05）。提示创面局部给予银杏叶提取物注射液激活了创面组织Wnt/β-catenin 信号通路活性，从而促进糖尿病足创口组织的修复。

本研究设置了普通溃疡组，将银杏叶提取物注射液治疗DFU 的效果与正常溃疡自然愈合的效果进行对比，用以表征银杏叶提取物注射液对于DFU大鼠溃疡的改善程度。同时，设置了普通溃疡+术前术后注射组、普通溃疡+术后注射组，发现术前术后注射的普通溃疡大鼠创面愈合率在术后2周内均显著高于未注射大鼠，且在第3周时，创面愈合率达到100%，效果优于未注射和仅术后注射的大鼠。

综上所述，DFU大鼠创面局部注射银杏叶提取物注射液治疗，可通过激活Wnt/β-catenin 信号通路，减少炎症细胞因子分泌，减轻氧化应激反应，有效提高创面愈合率，促进创面微血管生成，为临床DFU的治疗提供借鉴。