一个睑裂狭小-倒转型内眦赘皮-上睑下垂综合征家系FOXL2基因突变筛查及蛋白质构象分析

薛敏 姜丽丽 高颖

睑裂狭小-倒转型内眦赘皮-上睑下垂综合征(blepharophimosis ptosis and epicanthus inversus syndrome, BPES) (OMIM# 110100)是一种罕见的先天性常染色体显性眼睑发育异常的遗传性疾病,发病率约为1/50,000[1]。 BPES患者眼睑发育异常主要表现为睑裂狭小、上睑下垂、倒转型内眦赘皮。少数病例还合并智力低下、发育迟缓、先天性心脏病等系统性疾病。根据卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)的存在与否，BPES被分为两个亚型: I型以眼睑畸形和女性不育为特征；lI型仅以眼睑畸形为特征[2]。BPES基因已被定位于染色体3q23，并且FOXL2(OMIM#605597)基因的突变可导致两种亚型BPES的发生[3]。FOXL2基因是winged-helix/forkhead转录因子家族的成员，长度为2.7 kb，仅含有一个外显子[3，4]。研究显示FOXL2蛋白表达于眼睑发育过程的间质细胞、卵巢颗粒细胞和促性腺的垂体前叶细胞，这表明FOXL2蛋白可能在脊椎动物调节眼睑和卵巢的早期发育以及维持女性性腺的功能中发挥着关键作用[4-7]。我们对一个先天性BPES家系中所有患者、家系中正常人及10名正常对照者进行FOXL2基因突变筛查，并对突变前后的蛋白质构象进行对比分析，以期阐明该家系患者的分子遗传学致病机理。

资料与方法

一、临床资料

于安徽省第二人民医院收集一先天性BPES大家系(图1)。家系中共有18名成员，其中有7例BPES患者，男性5例，女性2例，平均年龄41岁；详细病史调查和临床眼科检查，并根据以下标准诊断BPES[8]：先天性睑裂狭小，内眦距过宽，上睑下垂，倒转型内眦赘皮。POF定义为40岁之前卵巢功能早衰[9]。先证者(Ⅲ：7)男性，6岁，视力：右眼0.4、左眼0.6；双眼睑裂横径20 mm；上下径1.9 mm；两内眦间距48 mm、外眦间距88 mm，倒转型内眦赘皮。随机选取10名在我院体检中心体检、无BPES病史和其他遗传病史的健康人为正常对照组。遵守《赫尔辛基宣言》关于人类样本采集指南的医学伦理要求在知情同意原则下采集家系中所有患者和健康成员，以及正常对照者的外周静脉血2 ml，EDTA抗凝冻存备用。

图1 BPES家系遗传图谱。图中Ⅰ：第一代；Ⅱ：第二代； Ⅲ：第三代； Ⅳ：第四代：正常男性等图标未插入

二、提取基因组DNA

从外周静脉血中采用DNA抽提试剂盒(大连宝生物生物工程有限公司)提取基因组DNA，溶于TE溶液中。光电比色计测定DNA纯度及浓度后冻存备用。

三、引物设计

应用Primer 5软件设计4对互相重叠的引物(表1)，引物由大连宝生物生物工程有限公司合成，目标扩增区域覆盖全部外显子及其前后的相邻的部分内含子。

表1 FOXL2基因编码区引物序列、位置、扩增片段长度及退火温度

四、PCR扩增目的基因

PCR扩增使用PTC-2000型温度梯度PCR仪(美国 MJ Research 公司)。PCR反应体系：100 ng基因组DNA, 25 μl 2 × GC-rich bufferⅡ, 8 μl dNTP Mixture (2.5 mmol/l)， 1 ULA Taq，正反向引物各2 μl (10 mol/l)， 加双蒸水至最终体积50 μl。PCR扩增首先94 ℃预变性5 min，随后进行35个循环，每个循环94 ℃变性60 s，60 ℃或63 ℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，最后在72 ℃进行10 min再次延伸。所有PCR产物均经2%琼脂糖凝胶，恒压120V电泳30 min证实为目标片段。患者的4F/4R PCR片段经上述方法观察，可以隐约看到双带，而正常人为清晰的一条短带，怀疑有插入突变，遂经4%琼脂糖凝胶电泳进一步分离条带(图2)，紫外线灯下切取大分子量片段并纯化回收(杭州爱思进DNA凝胶回收试剂盒)。

图2 患者及正常人4F/4R PCR产物4%琼脂糖凝胶电泳对比图

五、PCR产物测序

PCR产物送至大连宝生物生物工程有限公司双向直接测序，DNAStar软件分析测序结果。

六、序列预测及对比

应用ExPASy和predictprotein软件对突变前后的蛋白质结构进行预测及对比。

结 果

一、临床表现

家系中的患者均表现为典型的BPES眼部特征：睑裂狭小，上睑下垂，倒转型内眦赘皮，内眦距过宽。没有一例患者出现小头畸形、智力障碍、发育迟缓或其他系统性疾患。所有成年女性患者都有后代，适龄女性月经正常，女性患者没有POF的迹象，可认定此为BPESⅡ型家系。通过家系遗传图谱分析其遗传特征，符合常染色体显性遗传的特点。

二、测序结果

FOXL2基因的PCR双向直接测序结果表明所有BPES患者都有C.749～778 dup 30 (g.1164～1193 dup 30)的重复突变，家系中的正常人及10例正常对照均未见突变(图3)。

图3 家系患者C.749～778 dup 30重复突变序列与正常人对应序列对比。A图：家系先证者FOXL2基因外显子4F引物的正向测序结果,划线部分示重复突变位。B图：家系中正常人FOXL2基因对应位点的测序结果。

三、蛋白质结构预测及对比结果

1.一级结构预测结果：家系患者C.749～778 dup 30的重复突变引起了FOXL2编码的氨基酸肽链的扩增，由376增加到386(插入PAASYGPYTR10个氨基酸),相应蛋白质的分子量由38772.02变为39836.19；等电点由9.26变为9.31。

2.二级结构预测结果 ：C.749～778 dup 30使得突变后α-螺旋的比例增加了0.6%，β折叠和无规卷曲所占比例分别下降了0.1%和0.5%(表2)。

表2 FOXL2基因突变前后蛋白质构象对比分析

讨 论

BPES是一种严重的眼部疾患，它不仅可以累及眼部，还可以并发全身多系统疾患，尤其当合并卵巢功能早衰，可以导致女性患者不孕，因此从分子遗传学水平上分析其致病机制具有重要临床意义。FOXL2是一种Forkhead转录因子，编码376个氨基酸，其编码区包含重要的DNA结合Forkhead结构域(氨基酸位点52～152)和其下游的Poly-Ala串(氨基酸位点221～234)。到目前为止，在不同的种族中已经有超过200个FOXL2突变位点与BPES的发生有关[10-14]。之前的研究表明FOXL2存在两个突变热点:30%的突变导致poly-Ala扩增，13%是一种新的框外重复突变。在所有BPES基因突变中，基因内突变占了最大的比例(71%)[15]。FOXL2基因缺失和转录区域外突变分别占分子缺陷的12%和5%。基因内突变最常见的是移码突变(44%)，其次是框内突变(33%，其中多聚丙氨酸扩增最多)、无意义突变(12%)和错义突变(11%)[16]。随着FOXL2突变位点的不断增加，研究者发现了几种基因型-表现型的关系[17，18]：突变导致蛋白质Poly-Ala串前截断多导致I型BPES，而突变导致蛋白质产物延伸多导致II型BPES,但没有明确基因型和表现型的关系，这是因为BPES家族内部和家族之间存在遗传和临床异质性[19-22]。

本研究对一个BPES大家系的所有患者、正常人及10名正常对照进行FOXL2基因的突变检测及突变前后蛋白质构象对比分析， 在家系所有患者中均检测到C.749～778 dup 30突变，该突变发生在Poly-Ala串的下游，突变导致所翻译的蛋白质延长10个氨基酸，患者临床表现为BPESⅡ型，我们的结果支持De Baere[18]关于基因型-表现型关系的推断：突变引起蛋白质产物延伸多导致II型BPES。通过对突变前后蛋白质构象预测，突变后蛋白质的等电点、分子量、二级结构都有明显的改变。α-螺旋由8.5%增加到9.1%，该结构位于跨膜区内，De Baere[18]指出：在重复突变中，由后面肽链暂时形成的螺旋将有可能形成一个包括这个重复前半部分和其前面序列的发夹结构，重复的后半部分将和模板自由结合成双链。此发夹结构的形成将有可能直接改变蛋白质与蛋白质的相互作用，这有可能是此家系患者的致病机制。到目前为止，FOXL2基因C.749～778 dup 30突变尚未见文献报道。

综上所述，我们对一个BPES家系FOXL2基因进行突变筛查及蛋白质构象对比分析。在此家系患者中发现了一个新的FOXL2基因C.749～778 dup 30突变位点。通过对蛋白质构象的预测发现，突变前后蛋白质一二级结构都有不同程度的改变，这有可能和其致病机制密切相关。我们的研究结果扩大了FOXL2基因突变谱的范围，为FOXL2蛋白提供了新的的结构功能见解，对BPES的产前诊断和遗传咨询具有重要临床意义。