miR-146a在慢阻肺患者中的表达及其意义*

张星星，杨勤军，王小乐，高雅婷，王胜，孙泰，李泽庚，

1 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

2 安徽中医药大学 安徽合肥 230032

3 安徽省中医药科学院中医呼吸病防治研究所 安徽合肥 230031

我国慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）患病率﹑致残率和病死率高，经济负担重[1]。根据我国慢阻肺最新流行病学资料显示，慢阻肺成人患病率达8.6%，患病人口接近1亿，20～39岁年龄段患病率2.1%，而40岁以上年龄段患病率由之前的8.2%攀升至13.7%[2]。其关键特征是慢性气道炎症和黏液高分泌[3]。目前越来越多研究发现，miRNA参与调节慢阻肺气道炎症反应，尤其miRNA-146a已被研究证实可参与慢阻肺炎症反应调节机制，并能负性调控炎症因子分泌，已成为慢阻肺治疗的关键靶点[4-5]。本研究通过比较慢阻肺患者和正常人群外周血miR-146a的差异表达，探讨慢阻肺发病机制。

资料与方法

1 研究对象

研究病例来源于2019年6月—2019年12月安徽中医药大学第一附属医院呼吸内科门诊招募的慢阻肺稳定期患者，严格按照纳排标准筛选出40例慢阻肺稳定期患者，设为慢阻肺组。并于本院体检中心筛选20例健康状态的正常人群作为正常对照组。

2 纳入﹑排除标准

2.1 纳入标准 符合中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）》慢阻肺稳定期诊断标准[6]；年龄在40～75岁；既往3个月内未服用激素类药物；未参加其他临床研究；自愿参加本研究并签署知情同意书（伦理委员会批件文号：2016AH-25）。

2.2 排除标准 不符合纳入标准者；合并严重心﹑肝﹑肾疾病者；合并支扩﹑支气管哮喘﹑肺结核﹑肺部肿瘤等其它肺部疾病者；合并风湿免疫系统疾病且近1个月内曾用过免疫抑制剂等药物者；合并精神疾病病史者；处于妊娠及哺乳期妇女者。

3 实验方法

3.1 收集血清 抽取2组空腹静脉血，于本院临床实验中心离心留取血清，-80℃冰箱储存备用。

3.2 RT-qPCR 法检测血清miR-146a mRNA表达水平用RNAiso（货号9113）提取血清总RNA，取1μl RNA 样品，紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，纯度为1.8-2.1。按照miRNA First Strand cDNA Synthesis （Tailing Reaction）（B532451）试剂盒说明书操作步骤进行反转录，PCR体系用TB Green Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus）染料，上游引物序列：AATTGAGAACTGAATTCCATGGGTT，下游通用引物由生工公司提供（具体序列公司保密），以U6作为内参，Relative Quantification Study为分析方法，最终相对表达量取2-△△Ct。

4 统计学方法

使用IBM SPSS Statistics 23软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间比较，因该篇数据不满足正态性和方差齐性，故采用Mann-Whitney U检验。

结 果

1 2组一般资料

见表1。研究对象在性别﹑年龄一般资料方面无统计学差异（P＞0.05）。

表1 2组一般资料

2 2组对象血清miR-146a mRNA表达水平比较见表2。

表2 2组血清miR-146a mRNA表达水平比较（±s）

表2 2组血清miR-146a mRNA表达水平比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05。

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讨 论

慢阻肺是一种常见的可以预防和可以治疗的疾病，以持续存在的呼吸道症状和持续气流受限为特征，常与有毒颗粒和/或气体显著暴露致气道和（或）肺泡异常相关，炎症仍是慢阻肺进展的核心机制[7]。微小RNA（miRNA）是一类广泛存在于真核生物体内的长度约为21～25个核苷酸组成的进化保守的内源性非编码蛋白质的单链小分子RNA[8]，可同时调节基因和基因网络的表达，能够诱导信使RNA （mRNA）的降解，抑制mRNA的翻译，是重要的基因调节因子[9]。研究发现miRNA在调节慢阻肺﹑哮喘和气道重塑等不同炎症过程中发挥重要作用，而且还发现miRNA在慢阻肺中的病理生理作用及其在疾病中的差异表达，参与慢阻肺的发病和发展，被证明是一种有效且有潜力的慢阻肺诊断的生物标志物[10-11]。其中，miR-146a定位于第五号染色体的第二个外显子区，是miRNA家族中序列高度保守的因子之一[12]。已被证实可参与慢阻肺炎症反应调节机制[13]，可通过负反馈调节方式下调炎症因子分泌[14]，降低IL-6﹑TNF-α等炎症因子的水平[15]。研究表明miR-146a可抑制环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达，众所周知COX-2是一种促炎趋势诱导因子，其过表达是促进慢阻肺发生发展的重要原因之一[16]。而miR-146a也可通过调控COX-2的表达来影响慢阻肺的进展[17]。并且，还有研究证明miR-146a还可调节慢阻肺的黏液高分泌状态[18]。

综上所述，miRNA-146a可参与调节慢阻肺的炎症反应，具有一定的抗炎作用，是一种有效且有潜力的慢阻肺诊治新靶点。故本项目初步开展了小样本研究，比较了miR-146a在慢阻肺患者及正常人体血清中的差异表达，结果显示慢阻肺患者血清中的miR-146a相对表达量低于正常人群，提示miR-146a在慢阻肺人群中呈现低表达水平，致其抗炎作用减弱，可能与其调控的炎症通路相关。因本团队“慢性阻塞性肺疾病综合管理平台”的开发周期尚短，正在逐渐完善当中，故该研究的样本量尚不充分，下一步继续借助上述平台，扩大研究中心范围，拟收集更多慢阻肺患者，筛选更多的样本量，进一步开展慢阻肺的临床研究，同时实施miRNA-146a调控的慢阻肺炎症机制探讨研究，为慢阻肺防治寻找新的策略。