Claudin-6基因在食管鳞状细胞癌组织中的表达

张俊会,李 辉,赵丽岩,聂红峰,孟庆聚,郑书深,申社林,李 娜,魏世平

(1.邢台医学高等专科学校，河北 邢台 054000；2.邢台市第一医院，河北 邢台 054000)

Claudins是组成细胞间紧密连接必不可少的骨架蛋白，有27个成员[1]，其异常表达与多种肿瘤的发生、侵袭与转移有关，近来研究发现不同肿瘤组织中有不同的claudin表达，是肿瘤治疗的有效靶点[2]。食管癌是由食管黏膜上皮或腺体发生的消化道恶性肿瘤，我国是食管癌高发地区之一[3]。我们检测了claudin-6基因在食管鳞状细胞癌组织中的表达，并探讨其与临床病理参数的相关性，以期为临床食管癌的诊断和预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

邢台医学高等专科学校第二附属医院病理科2016-12—2018-12月留存的42例食管鳞状细胞癌石蜡包埋组织，其中低分化15例，高分化、中分化共27例；男性30例，女性12例；年龄43～97岁，平均(63±9.58)岁。以上病例手术前均未进行放疗和化学药物治疗。对照组为12例正常食管上皮组织。

1.2 试剂

Claudin-6抗体购自Affinity公司，免疫组化试剂盒、原位杂交检测试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。Claudin-6 mRNA寡核苷酸探针：从基因库中查找到claudin-6基因的全序列(LOCUS:NM_021195,1389bp,mRNA)，依此设计探针序列为：5′-TCAGG ACGAC TCCCA GGATC TGCAT TCCGG CA-3′，地高辛标记，由上海生工生物技术公司合成。

1.3 方法

免疫组化法：将制好的石蜡切片经63℃加热、二甲苯及梯度乙醇脱蜡至水，柠檬酸抗原修复液抗原修复2 min(高温高压条件下)，其后的操作方法依据试剂盒说明书进行，DAB显色剂显色，苏木素复染后中性树胶封片。

原位杂交法：在无RNA酶环境进行操作，组织切片依常规方法脱蜡至水。用蛋白酶在37 ℃条件下消化30 min，使mRNA核酸片段充分暴露。加预杂交液40 ℃预杂交3 h。滴加杂交液，专用盖玻片覆盖,恒温箱40 ℃杂交过夜。滴加生物素化鼠抗地高辛试剂，37 ℃条件下孵育60 min。滴加SABC，37 ℃条件放置20 min。滴加亲和素化过氧化物酶，37 ℃环境孵育20 min。显色剂使用DAB。

1.4 结果判定

免疫组织化学方法检测claudin-6表达，其阳性表达于细胞膜及胞质内(图1～2)，原位杂交法检测claudin-6 mRNA阳性表达出现在细胞质内(图3～4)。判定标准[4]：观察阳性染色的强弱并记分，无着色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)及棕褐色(3分)；观察阳性着色细胞数并赋分值，在每张切片上选取5个视野(200倍)计数阳性细胞的百分比，阳性细胞数≤10%、11%～50%、51%～75%及75%以上分别计1、2、3、4分。两项得分相乘得分大于3分者为阳性。

图1 Claudin-6在正常食管黏膜上皮的阴性表达(免疫组织化学染色 ×200) 图2 Claudin-6在中分化食管鳞癌的阳性表达(免疫组织化学染色 ×200)

图3 Claudin-6 mRNA在正常食管黏膜上皮的阴性表达(原位杂交染色 ×100) 图4 Claudin-6 mRNA在高分化食管鳞癌的阳性表达(原位杂交染色 ×200)

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0处理数据，组间率(%)的比较采用χ2检验。检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Claudin-6在正常食管上皮组织及食管鳞状细胞癌中的表达

在正常食管上皮组织及食管鳞状细胞癌中，claudin-6及claudin-6 mRNA阳性表达率为25%、64.3%及25%、69%，组间阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 Claudin-6在正常食管上皮组织及食管鳞状细胞癌中的表达

2.2 Claudin-6与食管鳞状细胞癌临床生物学行为的关系

Claudin-6及Claudin-6 mRNA表达均与食管鳞状细胞癌组织分化程度有关(P<0.05)，二者在浸润深度、有无淋巴结转移及年龄、性别组内的表达差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 Claudin-6与食管鳞状细胞癌临床生物学行为的关系

3 讨 论

紧密连接(tight junctions,TJS)是细胞间的重要连接体，其与细胞正常结构和生理功能均密切相关，参与细胞的极性排列及细胞之间信号传递[5-6]，紧密连接包括claudins、occlaudin和连接黏附分子(JAMs)等，其中claudins起主要作用。Claudins在人体多种组织中均有表达，其表达异常可导致上皮细胞极性丧失，细胞间黏附力下降，导致肿瘤发生发展[7-8]。不同claudins在食管癌中表达不同，同一种claudins在不同病理类型的食管癌中表达也不一致。姜琳娜等[9]发现claudin-7在食管鳞癌组织中的表达较癌旁组织明显增多，左剑辉等[10]发现在食管鳞癌组织中claudin-10表达显著高于手术切缘食管黏膜组织，Sung等[11]发现食管鳞癌中claudin-4低表达，Shi等[12]发现食管鳞癌组织中claudin-4及claudin-4 mRNA均呈低表达且claudin-4低表达与肿瘤分期、淋巴结转移和复发与否相关。在食管腺癌中，Takala等[13]发现claudin-3、claudin-4及claudin-5呈高表达，而在正常食管鳞状上皮中表达很低。有研究表明[14-15]，claudin-3在食管腺癌中高表达，claudin-4在食管腺癌中表达适度增加，而claudin-7在食管腺癌及正常食管上皮细胞中的表达未见明显差异。王军等[16]研究发现，食管腺癌组织中claudin-3 mRNA及claudin-3表达明显高于正常食管黏膜，而食管鳞癌组织中claudin-3 mRNA及claudin-3表达与正常食管黏膜相比变化不明显。同时有研究[17]发现claudin-2在食管腺癌中比Barrett食管中的表达更显著。

本研究中claudin-6 mRNA及claudin-6在食管鳞状细胞癌中的表达显著高于正常食管上皮组织，提示claudin-6高表达与食管鳞状细胞癌发生有关，与相关文献[9-10]报道类似。食管鳞状细胞癌组织中claudin-6及claudin-6 mRNA的表达在高、中分化组的阳性表达率明显高于低分化组，表明二者的表达与食管鳞状细胞癌组织分化程度有关。同时本研究发现claudin-6及claudin-6 mRNA的表达与食管鳞状细胞癌组织的浸润深度及淋巴结转无相关。食管癌发生发展的具体机制较为复杂，细胞间黏附结构的破坏和极性丧失是上皮细胞恶性转化的标志[12]。Claudins与细胞极性和细胞间黏附力有关，claudins家族不同成员在食管癌中表达不尽相同，claudin的表达缺失可导致肿瘤发生和发展。Kuo等[18]通过对食管鳞状细胞癌手术标本分析认为Nm23H1表达减少激活了Akt信号通路，从而使claudin-1表达减少，导致食管鳞癌细胞侵袭性增强。而claudins表达升高与肿瘤发生和发展的确切机制尚不清楚，有待进一步深入研究。