莪术愈创木烷型倍半萜化合物改善高脂饲料ApoE-/-小鼠脂质代谢和肝脏脂肪变性的机制研究

别玉龙 宋博策 谢蓓莉 刘明旺 史大卓 赵福海

肝脏是脂肪转化、代谢的重要场所，当循环中血脂升高之后，大量脂质在肝脏实质细胞内沉积，导致肝细胞发生脂肪变性，形成大量脂滴，进一步加剧炎症反应和氧化应激损伤，加剧肝细胞损伤，导致肝脏功能异常[1]。肝脂酶(hepatic lipase，LIPC)属于脂肪分解酶家族成员，由肝细胞合成分泌，参与甘油三酯和磷脂的水解过程[2]。同时LIPC位于肝细胞及肝内皮细胞表面，能够促进高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein, HDL-c)及载脂蛋白-B的摄取，调节肝脏脂肪代谢。研究证明，LIPC与动脉粥样硬化及冠心病等代谢疾病关系密切[3-4]。

莪术愈创木烷型倍半萜化合物是从中药莪术中发现的一种新的活性成分。前期研究发现，莪术愈创木烷型倍半萜化合物具有保护血管内皮细胞、抗氧化应激损伤等作用[5]。但莪术愈创木烷型倍半萜化合物是否具有调节脂质代谢、保护肝脏中的作用，尚缺少报道。因此，本研究观察莪术愈创木烷型倍半萜化合物对高脂饲养ApoE-/-小鼠血脂、肝脏脂质沉积及肝功能的影响，为其临床转化应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物 SPF级雄性ApoE-/-小鼠30只，同源雄性C57/BL小鼠10只，体质量(20±2)g，北京维通利华公司提供，合格证书号：SYKX(京)2016-0006。实验方案获得西苑医院动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

试剂：莪术愈创木烷型倍半萜化合物，由中国科学院大连化学物理研究所提供。改良苏木素—伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)试剂盒(批号：9161033)、饱和油红O染色液(北京索莱宝生物科技有限公司，批号：410K034)；兔抗LIPC抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：AG03292292)；羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：200061221)；谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST/GOT)测试盒(批号：20201219)、碱性磷酸酶(alanine aminotransferase,AKP)测试盒(批号：20201222)、谷丙转氨酶(alkaline phosphatase,ALT/GPT)测试盒(批号：20201218)，均购自南京建成生物工程研究所；高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(批号：201361)、低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(批号：201441)、甘油三酯测定试剂盒(批号：198021)、胆固醇测定试剂盒(批号：192061)，均购自北京中生北控生物科技股份有限公司；其他试剂为国产分析纯。

仪器：多功能酶标仪(美国 biotek公司，型号：synergy2，分析软件：gen 5)；冰冻切片机(美国Thermo公司，型号：Cryotom e)；全景扫描显微镜(日本 Olympus公司，型号：VS120)。

1.3 动物分组与给药

动物适应性喂养1周后，将ApoE-/-小鼠随机分为模型组、倍半萜组和阿托伐汀治疗组，每组各10只，给予高脂饮食(胆固醇3%、胆酸钠0.5%、蛋黄粉6%、白糖4%、猪油18%、丙基硫氧嘧啶0.3%、标准饲料68.2%)。正常对照组为同源C57/BL6 小鼠10只，给予普通饲料。小鼠自由饮食、水，明、暗光交替12小时，恒温、恒湿环境喂养。倍半萜组小鼠给予10 mg/kg剂量生理盐水混悬，灌胃；阿托伐汀治疗组给予10 mg/kg剂量生理盐水混悬，灌胃；正常对照组、模型组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃。各组小鼠每天灌胃给药一次，连续给药12周后取材、处死。

1.4 检测指标

实验12周后，4%水合氯醛以0.10 mL/10 g腹腔注射麻醉，固定，打开腹腔，取出肝左外叶，置于4%多聚甲醛固定液中，4℃，24小时充分固定，梯度蔗糖水溶液(10%～30%)脱水，使用OCT冷冻包埋，冰冻切片机切片，厚度为6 μm。

1.4.1 HE染色 切片置于蒸馏水中洗涤10分钟，苏木素染色液染色5分钟，弱酸分化1分钟，氨水返蓝处理2分钟，伊红染液染色5分钟，95%～100%梯度酒精脱水，二甲苯透明1分钟，2次；中性树脂封片，光学显微镜下观察肝脏结构并记录。

1.4.2 油红O染色 切片置于蒸馏水中洗涤10分钟；油红O染液染色15分钟；60%异丙醇分化5秒后去除杂色；蒸馏水洗涤5分钟；Mayer苏木素染色液染色5分钟，复染细胞核；蒸馏水充分洗涤2分钟；氨水返蓝处理2分钟，蒸馏水洗涤2分钟；甘油明胶封片，光学显微镜下观察脂肪滴面积，拍照记录，每张切片取三个不同视野求平均值，每组取3只小鼠进行分析，Image-Pro plus 6.0软件分析肝脏脂肪滴占细胞面积比例。

1.4.3 LIPC免疫组织化学染色 切片置于PBS缓冲液洗涤10 分钟， 3%过氧化氢溶液封闭10 分钟，10%山羊血清室温封闭1小时，一抗(1∶200)4℃，12小时，PBS缓冲液洗涤5 分钟，3次，二抗(1∶200)室温孵育1小时，PBS缓冲液洗涤5分钟，3次，DAB显色液显色2分钟，苏木素染色5分钟，蒸馏水洗涤，95%～100%梯度酒精脱水，二甲苯透明1分钟，2次，中性树脂封片，光学显微镜下观察LIPC蛋白表达情况，拍照。每张切片取三个不同视野，每组取3只小鼠进行分析，Image-Pro plus 6.0软件分析肝脏LIPC表达情况。

1.4.4 血脂、肝功能检测 小鼠麻醉后主动脉取血，离心取血清，使用中生北控试剂盒进行检测，酶标仪检测，具体流程按照说明书进行。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠体质量的影响

各组小鼠体质量结果见表1。与入组第1周相比，各组小鼠在第5周后体质量均增加明显(P<0.01)；与第5周相比，模型组和倍半萜治疗组小鼠体质量增加明显(P<0.05，P<0.01)，空白对照组和阿托伐他汀组小鼠体质量增加不明显(P>0.05)；和第7周相比，正常对照组和阿托伐他汀组小鼠体质量增加明显(P<0.01，P<0.05)，倍半萜组和模型组体质量无明显增加(P>0.05)。各组小鼠体质量同时点相比没有统计差异(P>0.05)。

表1 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠体质量的影响

2.2 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠血脂水平的影响

各组小鼠血脂水平见表2。与正常对照组相比，模型组小鼠甘油三酯(triacylglycerol, TG)、总胆固醇(total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-c)明显增加(P<0.01)，HDL-c明显下降(P<0.01)；与模型组相比，倍半萜组和阿托伐他汀组TC、LDL-c明显下降(P<0.01)。

表2 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠血脂水平的影响

2.3 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝脏脂肪滴沉淀的影响

油红O染色结果见图1和表3。正常对照组小鼠肝脏切片仅有少量脂肪沉积，肝细胞致密排列整齐；与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏脂肪滴占细胞总面积比例明显升高(P<0.05)，肝细胞稀疏，排列紊乱；与模型组相比，倍半萜治疗组小鼠肝脏脂肪滴细胞总面积比例明显减少(P<0.05)，部分区域细胞排列紊乱情况有所恢复。阿托伐他汀组小鼠肝脏切片显示存在大量脂肪滴，细胞间隙增大，排列紊乱。

注： A正常对照组；B模型组；C倍半萜组；D阿托伐他汀组。图中红色颗粒为脂肪滴，蓝色为细胞核。

表3 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝脏脂肪沉积的影响

2.4 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝细胞损伤的影响

HE染色观察莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝细胞损伤影响，结果显示：正常对照组小鼠肝脏肝窦区细胞排列紧密，成条索样分布，结构清晰。模型组小鼠肝脏细胞稀疏，结构紊乱，大量肝细胞呈典型的“气球样”改变。倍半萜治疗组小鼠肝脏组织中部分区域紊乱明显恢复。阿托伐他汀组小鼠肝脏细胞稀疏，肝窦结构紊乱加剧。见图2。

2.5 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝脏LIPC蛋白表达的影响

免疫组化法观察莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝脏LIPC蛋白表达的影响，结果显示：与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠肝脏LIPC表达明显降低(P<0.05)。和模型组相比，倍半萜干预后LIPC表达明显升高(P<0.05)。见图3、表4。

注：A正常对照组；B模型组；C倍半萜组；D阿托伐他汀组。箭头表示肝细胞气球样变。

注： A 正常对照组；B 模型组；C 倍半萜组；D 阿托伐他汀组。图中棕色颗粒为LIPC，蓝色为细胞核。

表4 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝脏LIPC表达的影响

2.6 莪术愈创木烷型倍半萜化合物对小鼠肝功能的影响

各组小鼠ALT、ALP、AST表达水平见表5。与正常对照组相比，模型组小鼠ALT、AST、ALP水平升高明显(P<0.01，P<0.05)。与模型组比较，倍半萜组小鼠ALT、AST均明显下降(P<0.01)，阿托伐他汀组小鼠以上指标均无统计学意义。

表5 莪术愈创木烷型倍半萜对小鼠肝功能的影响

3 讨论

莪术为活血破瘀药，具有行气破血、消积止痛的功效，常用于胸痹心痛、饮食积滞、脘腹胀满等的治疗。莪术中包括姜黄素、莪术醇、β-榄香烯等多种活性成分[6]，研究发现莪术醇具有降低肝指数、血清ALT、AST活性，保护肝细胞，抑制转化生长因子β1发挥抑制肝脏纤维化的作用[7]；舒泳翔等[8]研究发现姜黄素能够抑制炎症因子释放，抑制肝细胞凋亡。本课题组从莪术中分离出来一种新型莪术愈创木烷型倍半萜化合物，其结构与姜黄素、莪术醇、β-榄香烯不同，同时发现该成分能抑制支架内再狭窄，有良好的保护血管内皮细胞和抑制血管平滑肌细胞增殖的作用[9-10]。此外，进一步研究发现还具有抗氧化活性，能够保护氧化应激损伤导致的内皮细胞凋亡[5]。

为进一步明确莪术愈创木烷型倍半萜化合物调节脂质代谢，抑制肝脏脂肪变性的作用机制，本实验观察了莪术愈创木烷型倍半萜化合物对高脂饲料ApoE-/-小鼠血脂水平和肝脏病理变化的影响。在此基础上观察了莪术愈创木烷型倍半萜化合物对肝功能及肝脏脂肪代谢关键酶LIPC蛋白表达的影响。结果表明，该成分能明显降低TC和LDL-c、ALT、AST含量；油红O染色结果显示莪术愈创木烷型倍半萜化合物能够抑制肝脏细胞内脂肪滴形成；HE染色结果发现莪术愈创木烷型倍半萜化合物干预后肝脏组织结构有所恢复，说明该化合物能够降低高脂饮食诱导的小鼠血清水平，抑制肝细胞脂肪变性，同时能够保护肝细胞，促进肝功能恢复。为了进一步研究莪术愈创木烷型倍半萜化合物调节脂代谢的机制，课题组采用免疫组化染色方法检测肝脏组织中LIPC蛋白表达，发现莪术愈创木烷型倍半萜化合物能够明显提高肝细胞中LIPC蛋白的表达。LIPC的高表达能够促进TC和TG分解代谢，提高脂蛋白摄取，调节脂代谢紊乱。本实验也发现在莪术愈创木烷型倍半萜化合物干预后小鼠肝脏组织中LIPC蛋白表达升高。因此LIPC可能是其发挥调解脂质代谢、减轻肝脏脂肪变性的一个潜在的靶点。综上，莪术愈创木烷型倍半萜化合物是一种较好的具有调节脂质代谢，保护肝脏功能的新成分，具有进一步研发价值。