加味芍甘附子汤对早期生长反应蛋白2调控胶原诱导性关节炎老年大鼠炎症的影响

钱唐亮 张玉婷 侯秀娟 刘小平 郑炜 康天伦 王海瑜

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性、侵袭性关节炎为主要表现的自身免疫疾病，30至50岁为其发病高峰[1]。根据发病年龄可将其分为两类，其中青年发病并迁延至老年的RA患者称为青壮年发病类风湿关节炎(younger onset rheumatoid arthritis，YORA)；60岁及以后发病的类风湿关节炎，称为老年期发病类风湿关节炎(elderly onset rheumatoid arthritis，EORA)[2]。EORA相比于YORA往往发病更急，关节肿胀的临床症状更加严重。在治疗上，EORA相比于YORA对抗风湿药物的耐药性差，需要更多的联合用药[3-4]，这就增加了老年患者本已不佳的身体负担。现在许多临床研究发现了中医药在RA治疗中发挥着重要的作用[5]。本课题组前期临床研究发现加味芍甘附子汤在改善RA患者的关节功能和生活质量方面疗效确切[6]，其主要通过调节Egr2为核心的炎性通路而达到免疫调节作用[7]。在此基础上，本实验进一步探讨加味芍甘附子汤对胶原诱导性关节炎(collagen induced arthritis，CIA)老年鼠早期生长反应蛋白2(early growth response protein 2，Egr2)表达及其下游炎症因子的影响，比较EORA与YORA临床特征差异化的内在机理，探索RA群体的治疗方案。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雌性Wistar大鼠96只，其中青年鼠[3～4月龄，体质量(256.9±12.7)g]48只，老年鼠[12～13月龄，体质量(391.15±58.5)g]48只，均购于北京维通利华实验动物技术公司，许可证号：SCXK(京)2012-0001。

1.2 实验药物

加味芍甘附子汤：白芍15 g、制附子15 g、鸡血藤15 g、甘草10 g、青风藤15 g(以上药物由北京中医药大学东方医院药剂科统一采购)，全部药材经煎煮、过滤、水浴蒸发至每mL药液含生药材1.42 g。雷公藤多苷片(湖南千金协力药业有限公司，规格：10 mg，生产批号：6936492500053)，用蒸馏水配制为1 mg/mL。

1.3 主要仪器及试剂

牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司)；不完全弗氏佐剂(美国Sigma公司)；TRIZOL(Invitrogen，型号10296028)；UltraPure Agarose(ABI-invitrogen，型号16500100)；SuperScript III RT 反转录kit(ABI-invitrogen)；高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；台式高速冷冻离心机(21RTHERMO)；核酸浓度测定仪(THERMO)；qPCR仪(美国Applied biosystems)。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及给药 大鼠适应性喂养1周后，按照随机数字表法分别将老年鼠与青年鼠分成正常组、模型组、对照组、中药组，每组各12只。正常组常规饲养，其余3组复制CIA大鼠模型后分别给予生理盐水、雷公藤多苷片及加味芍甘附子汤灌胃4周，每日灌胃剂量：雷公藤多苷片6.25 mg/kg，加味芍甘附子汤12.5g /kg，生理盐水0.2 mL/kg。每周评价各组大鼠关节炎症指数(arthritis index，AI)。

1.4.2 复制CIA大鼠模型 CIA模型根据徐淑云《药理学实验方法》，将牛Ⅱ型胶原溶于乙酸，与等量完全弗氏佐剂溶液混合，制备牛Ⅱ型胶原终浓度2 mg/mL混合物。将上述混合物置于15 mL离心管并垂直置于冰水中，离心管置于高速分散器下，以1 000～3 000 r/分钟搅拌2分钟，暂停30秒冷却，避免高速分散器转头搅拌过程中产热导致蛋白变性，并反复数次使蛋白充分乳化。期间检验蛋白乳化情况，即用针头挑取一滴混合物滴入水中不散，形成“油包水”状。随后按每只0.1 mL于大鼠左足及尾根部多点真皮内注射。压迫注射部位使乳化物完全吸收。7天后以相同方法和相同剂量在大鼠尾根部皮内加强免疫一次。根据AI评分剔除模型不成功的大鼠。每组剔除4只，剩余8只。

1.5 检测指标

1.5.1 AI评分 根据大鼠四肢各肢体肿胀程度及个数累计积分，以AI评分≥4分判定为模型复制成功，每周评价1次。AI评分标准如下：0分，无关节红肿；1分，小趾关节肿胀；2分，趾关节及足跖关节肿胀；3分，踝关节以下足爪肿胀；4分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。AI评分最高分为16分。

1.5.2 组织病理学检测 每组随机选取2只大鼠，根据大鼠体质量每100 g给予0.3 mL 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剥离大鼠后肢的关节外周组织，使膝关节和踝关节充分暴露，保留好关节囊，以膝关节和踝关节为中心，用骨钳剪断关节上下约0.5 cm，迅速放入0.4%的甲醛中固定。后期进行免疫组化及苏木精—伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色制作切片，在光学显微镜下进行观察。

1.5.3 外周血白细胞介素-17A检测 取大鼠腹主动脉血清，采用ELISA法检测细胞因子白细胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)、细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、干扰素-γ(interferon-γ，INF-γ)，根据试剂盒说明操作。

1.5.4 膝关节滑膜Egr2 mRNA表达情况 取膝关节滑膜组织置于液氮中保存，按照TRIzol使用说明书进行总RNA提取；按照反转录试剂盒说明书操作进行反转录；每个样本分别用待检测基因和内参基因引物扩增，每个反应做3个重复；统计学方法采用2-ΔΔCt法计算目的基因表达量；引物均在北京Invitrogen公司合成，见表1。

表1 引物序列

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 AI评分

给药期间，各组老年鼠AI评分均降低。给药1周和2周时，中药组与模型组AI评分比较差异具有统计学意义(P<0.05)。给药3周和4周时，对照组和中药组AI评分均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)，且中药组AI评分低于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 老年鼠各组CIA大鼠给药期间AI评分比较

给药期间，各组青年鼠AI评分均降低。给药1周和2周时，对照组和中药组AI评分均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)。给药3周和4周时，对照组和中药组AI评分均低于模型组(P<0.05)，且中药组AI评分低于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 青年鼠各组CIA大鼠给药期间AI评分比较

2.2 组织病理学观察

HE染色结果显示，老年鼠及青年鼠正常组的踝关节组织结构和滑膜组织正常。老年鼠模型组的关节腔明显狭窄，滑膜组织增生明显，大量滑膜细胞增生及炎性细胞浸润，局部坏死脱落。青年鼠模型组的关节腔可见明显狭窄，滑膜组织明显增厚，少量炎性细胞浸润，局部坏死脱落。老年鼠对照组可见关节腔狭窄，滑膜组织增厚，较多滑膜细胞增生及炎性细胞浸润。青年鼠对照组关节腔轻度狭窄，关节面光滑，滑膜组织原纤维增生，少量炎性细胞浸润，关节面局部血管翳侵入。老年鼠中药组关节腔未见明显狭窄，滑膜细胞轻微增生，少量炎性细胞浸润。青年鼠中药组关节腔未见明显狭窄，滑膜组织增生增厚，滑膜胶原纤维增生明显，少量炎性细胞浸润。见图1～4。

注：A 正常组；B 模型组；C 对照组；D 中药组。

注：A 正常组；B 模型组；C 对照组；D 中药组。

注：A 正常组；B 模型组；C 对照组；D 中药组。

注：A 正常组；B 模型组；C 对照组；D 中药组。

2.3 滑膜组织Egr2 mRNA表达水平

与老年鼠正常组比较，老年鼠模型组、对照组、中药组滑膜组织Egr2 mRNA的表达水平增高(P<0.05)；与老年模型组比较，老年鼠对照组和中药组滑膜组织Egr2 mRNA的表达水平明显增高(P<0.05)。与青年鼠正常组比较，青年鼠模型组、对照组、中药组滑膜组织Egr2 mRNA表达水平增高(P<0.05)；与青年鼠模型组比较，青年鼠对照组滑膜组织Egr2 mRNA表达水平明显增高(P<0.05)。老年鼠模型组滑膜组织Egr2 mRNA表达水平低于青年鼠的模型组(P<0.05)，老年鼠中药组滑膜组织Egr2 mRNA表达水平高于青年鼠中药组(P<0.05)。见表4。

表4 各组CIA大鼠滑膜组织Egr2 mRNA表达水平比较

2.4 外周血炎性细胞因子表达水平

与老年鼠正常组比较，老年鼠模型组外周血IL-17A、INF-γ、IL-6的表达水平增高(P<0.05)；与老年鼠模型组比较，老年鼠对照组和中药组的外周血IL-17A的表达水平降低(P<0.05)，老年鼠对照组的外周血INF-γ、IL-6的表达水平降低(P<0.05)；与老年鼠对照组比较，老年鼠中药组的外周血IL-17A的表达水平降低(P<0.05)。见表5。

表5 老年鼠各组CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比较

与青年鼠正常组比较，青年鼠模型组外周血IL-17A、INF-γ、IL-6的表达水平增高(P<0.05)；与青年鼠模型组比较，青年鼠对照组和中药组外周血IL-17A、INF-γ的表达水平降低(P<0.05)，青年鼠对照组外周血IL-6的表达水平降低(P<0.05)；与青年鼠对照组比较，青年鼠中药组外周血IL-17A的表达水平增高(P<0.05)。见表6。

表6 青年鼠各组CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比较

老年鼠与青年鼠外周血炎性细胞因子水平比较，老年鼠模型组外周血IL-17A的表达水平明显高于青鼠模型组(P<0.05)，老年鼠对照组外周血IL-17A的表达水平明显高于青鼠对照组，老年鼠对照组外周血IL-6的表达水平明显低于青鼠的对照组(P<0.05)，老年鼠中药组外周血IL-17A的表达水平明显低于青年鼠中药组(P<0.05)。见表7。

表7 老年鼠与青年鼠各组CIA大鼠外周血IL-17A、INF-γ、IL-6水平比较

3 讨论

有研究表明EORA患者的血沉和C反应蛋白均高于YORA[8]，且受IL-6、IL-17A等炎性因子的影响。相比于YORA患者，EORA患者往往发病更急，且关节肿胀的临床症状更加严重，可能与人体衰老而导致的机体炎症相关[9]。目前关于EORA差异于YORA临床表现的发病机理尚不明确，对该群体的特征化治疗还在不断的探索中。中医药治疗老年类风湿关节炎提倡从整体出发，兼顾老年人脾肾亏虚、正气不足的生理特点，灵活辨证，从而改善临床症状，降低实验室指标，达到缓解病情，改善预后的目的，临床应用价值较高。

加味芍甘附子汤是在《伤寒论》芍甘附子汤基础上加用藤类药物鸡血藤、青风藤，诸药合用共奏温经散寒、通络止痛之功效，临床常用于治疗类风湿关节炎寒湿痹阻型的患者。多个研究小组发现寒湿痹阻证在类风湿关节炎各个证型中占首位[10-12]。本课题组前期的临床研究发现，加味芍甘附子汤联合传统抗风湿药能够改善RA患者关节疼痛、晨僵等症状，改善RA疾病活动度评分和中医证候评分，降低血沉、C反应蛋白等炎性指标，在研究过程中还发现该方不会引起患者肝肾功能异常[13]。动物实验研究表明加味芍甘附子汤可抑制CIA老年大鼠的炎性因子IL-17A与IL-6的表达，从而对减缓其关节及肺脏组织炎症方面有良好的效果[14]，且Egr2在CIA模型鼠的中药中剂量组中高表达[15]，这也为本次实验中药剂量的选择提供了基础。前期的临床研究发现加味芍甘附子汤联合传统抗风湿药通过调节Egr2为核心的炎性通路而达到调节机体免疫的功效，从而抑制了炎性因子IFN-γ、IL-17A、IL-6的表达，达到抑制RA寒湿痹阻证患者的炎性反应，延缓病情的作用[16]。

本研究结果显示，加味芍甘附子汤可降低CIA老年鼠和青年鼠的AI评分，且在4周后中药组的评分最低，提示加味芍甘附子汤可有效减轻关节肿胀。各组大鼠组织病理学提示除正常组外，均有滑膜组织增生及炎性细胞浸润，老年鼠模型组的炎性细胞浸润明显重于青年鼠模型组，且中药组都明显轻于模型组，提示加味芍甘附子汤可显著抑制CIA大鼠的促炎作用，控制疾病进展。老年鼠和青年鼠滑膜组织Egr2的组内比较均显示对照组和中药组的表达高于模型组，说明加味芍甘附子汤和雷公藤多苷可上调滑膜组织Egr2的表达。老年鼠与青年鼠滑膜组织Egr2的组间比较显示，老年鼠模型组的滑膜组织Egr2的表达明显低于青年鼠模型组，而老年鼠中药组的滑膜组织Egr2的表达明显高于青年中药组，说明老年鼠的发病更重可能与Egr2的低表达相关，加味芍甘附子汤可以上调Egr2的表达，且在老年鼠更加突出。老年鼠与青年鼠炎性细胞因子的组内表达显示，老年鼠中药组的IL-17A表达低于模型组与对照组，青年鼠中药组的IL-17A、IFN-γ表达低于模型组，但高于对照组，说明加味芍甘附子汤可抑制CIA青年鼠和老年鼠外周血炎症因子的表达，且对IL-17A抑制更显著。老年鼠与青年鼠外周血炎性细胞因子的组间比较显示，老年鼠模型组及对照组外周血IL-17A的表达均高于青年鼠，而老年鼠中药组的表达低于青年鼠，说明加味芍甘附子汤抑制CIA老年鼠外周血IL-17A的表达比青年鼠更具优势。

综上所述，CIA老年鼠滑膜细胞Egr2的低表达为其参与炎症过程的可能因素之一。Egr家族是一类能被多种刺激因素诸如缺氧、感染等诱导产生的转录因子。现有的研究发现，该家族包括Egr1、Egr2、Egr3和Egr4四个成员，主要参与细胞的生长、发育、增殖以及凋亡等过程[17]。其中Egr2由T细胞受体参与诱导，是诱导T细胞失能所必需的物质[18-19]。Egr2在活化的T细胞中被高度诱导，负向调节T细胞的活化，以控制过度炎症[20-21]。现有的研究发现Egr2直接连接细胞因子信号传导抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling，SOCS)1和SOCS3的启动子，并通过诱导其活性而上调SOCS1/SOCS3的表达水平[22-24]。SOCS1/SOCS3是信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription，STAT)1和STAT3活化的抑制剂，主要通过STAT1/STAT3正调控Th1与Th2细胞的分化来实现[25]，而Th1和Th17细胞可分别产生IFN-γ和IL-17，其中IL-17A是最主要的效应分子，具有较强的促炎症作用，可诱导产生多种炎症介质，如IL-6、IL-8等，从而引发局部或全身的炎症反应[26]。在RA急性期IL-17A可刺激不同类型细胞分泌各种炎性细胞因子，破坏骨修复系统，导致关节肿胀变形，因此急性期的RA患者往往病情严重，骨侵蚀明显[27-28]。EORA往往发病更急，更加严重的关节肿胀症状很有可能与IL-17A表达水平升高相关。加味芍甘附子汤可能通过对Egr2的调控而抑制IL-17A为主的炎性细胞的分泌，从而改善CIA老年鼠关节滑膜炎症。本实验样本量小，且是对中药治疗EORA的初步探索，后期还需大量的实验和临床研究来验证。