基于UPLC－Q－TOF MS的广佛手指纹图谱建立及炮制前后成分差异分析

吴学峰，周 熙，黄晓兰，吴惠勤，谢 斌*

（1.广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070；2.广州海关技术中心，广东 广州 510623）

广佛手为芸香科柑橘属植物佛手Citr us medicaL.var.sarcod act ylisSwingle的干燥果实，切片晒干可得生广佛手，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的功效［1］。广佛手主产于广东高要、德庆等地，作为传统南药，近年来已被《广东省岭南中药材保护条例》收录为第一批受保护的岭南中药材。制广佛手是岭南特色饮片，由生广佛手炮制晾干制得，在广东地区的临床应用中，制广佛手较生广佛手更为常用。中药炮制后，化学成分往往会发生变化，继而改变药材的性味和功效，因此揭示广佛手炮制前后化学成分的变化规律显得尤为重要。目前，生、制佛手的化学成分差异研究主要集中在挥发性成分，如罗朵生等［2］、汪金玉等［3］采用气相色谱－质谱（GC－MS）技术研究佛手炮制前后的挥发油成分差异，发现经炮制后，佛手中的饱和化合物含量增加，不饱和化合物含量降低。而难挥发性成分的变化规律研究较薄弱，仅汪金玉等［4］研究发现广佛手炮制前后5-羟甲基糠醛的含量增加明显，揭示炮制中发生了美拉德反应，同时橙皮苷、5，7-二甲氧基香豆素的含量也发生变化。

主成分分析（PCA）与正交偏最小二乘法判别分析（OPLS－DA）等化学模式识别方法是区分药材、筛选中药差异性成分和寻找化学标志物的重要方法，在中药质量控制、组效关系研究中具有重要意义［5］。中药指纹图谱是中药真伪鉴定、质量一致性和稳定性评价的可行性方法［6－7］。李金玉等［8］收集广东高要不同收期的20个样品建立了佛手的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，选定橙皮苷与5，7-二甲氧基香豆素为参考成分，发现相同采摘期佛手的化学成分及含量存在差异；郑振兴等［9］用31批佛手建立HPLC指纹图谱，可用于鉴别佛手真伪与区分同科同属植物。但佛手的HPLC指纹图谱仅提供其化学成分及色谱峰保留时间信息，缺乏色谱峰的定性数据，又因紫外检测器吸收波长的选择性，难以较全面表征佛手复杂的化学成分。超高效液相色谱－四极杆串联飞行时间质谱（UPLC－Q－TOF MS）具有高灵敏度、高分辨率及强大的定性表征能力，可弥补HPLC的不足，因此采用UPLC－Q－TOF MS建立中药及中成药指纹图谱具有良好的发展前景。

本研究采用UPLC－Q－TOF MS建立生、制广佛手的指纹图谱，所得指纹图谱不仅反映了广佛手的难挥发性化学组成，还能提供色谱峰的定性数据，可较全面地表征生、制广佛手的化学成分，并可用于广佛手真伪鉴别。在此基础上，结合数理统计方法，分析生广佛手经炮制后难挥发性成分的变化并找出显著性差异成分，对于揭示其炮制内涵和开展生、制广佛手的质量控制具有重要意义。

1 实验部分

1.1 试剂与样品

5，7-二甲基香豆素、佛手苷内酯、香叶木苷、香叶木素、诺米林、黄柏酮、6，7-二甲氧基香豆素、棕榈酸、原儿茶酸、圣草次苷、佛手酚、α-亚麻酸、油酸、橙皮素购于成都瑞芬思生物科技有限公司；水合氧化前胡素购于上海诗丹德生物技术有限公司；阿魏酸、柠檬苦素、橙皮苷、芦丁、欧前胡素购于广州分析测试中心科力技术开发公司；壬二酸购于成都格雷西亚化学技术有限公司；苹果酸购于常州新华活性研究所。所有对照品纯度均大于98%。

甲醇、乙腈（色谱纯）购自德国Merck公司；蒸馏水购自中国香港屈臣氏公司；甲酸（色谱纯）购自美国Fisher Scientific公司；乙酸铵（色谱纯）购自美国Sigma－Aldrich公司。

11批次生广佛手产地均为广东肇庆，其中10批次购自佛山市大沥镇黄芪联益贸易部，1批次购自广州市越秀区大参林药房，分别编号为SG1～SG11。称取各批次生广佛手约50 g，充分润湿后用纱布包裹置于蒸锅中，待水沸腾后转小火，继续炮制2.5 h，自然降温后于50℃恒温干燥箱中烘干［3］，即得制广佛手样品，分别编号为ZG1～ZG11。样品信息见表1。

表1 广佛手样品编号和详细信息Table 1 Fingered Citron sample number and details

1.2仪器

1290液相色谱－G6540系列四极杆－飞行时间质谱联用仪，配有电喷雾离子源（ESI），MassHunter数据采集系统（美国安捷伦科技有限公司）；TP－114型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；JP－060超声波清洗机（深圳市洁盟七夕设备有限公司）；H1850R离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；DH9－9071A电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1供试品制备将样品粉碎后过3号筛（孔径0.355 mm），精密称取1.0 g样品置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL无水甲醇，摇匀，称定重量，超声1 h后取出，冷却至室温。称定重量并用甲醇补足失重，摇匀，取上层液体以14 000 r/min离心10 min，上清液即为供试品溶液。质控样品（QC）由各样品各取100μL混合制得。

1.3.2对照品溶液制备分别称取各对照品适量溶于甲醇，制得质量浓度约为1 000 mg/L的单一对照品溶液。临用前取各对照品储备液适量并混合，用甲醇稀释至10 mg/L，即得混合对照品溶液。

1.3.3色谱条件色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC－C18柱（3.0 mm×150 mm×2.7μm）；流动相为：A（0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸铵水溶液）－B（乙腈）。梯度洗脱程序：0～5 min，95%～90%A；5～10 min，90%～88%A；10～35 min，88%～80%A；35～50 min，80%～70%A；50～65 min，70%～60%A；65～70 min，60%～30%A；70～78 min，30%～10%A；78～81 min，10%～2%A；81～84 min，2%A；84～84.1 min，2%～95%A；84.1～88 min，95%A。流速：0.5 mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃；检测时间：88 min。

1.3.4质谱条件毛细管电压：3 500 V；喷嘴电压：1 000 V；毛细管出口电压：150 V；锥孔电压：65 V；干燥气（氮气）温度：300℃；干燥气（氮气）流速：8 L/min；鞘气（氮气）温度：350℃；鞘气（氮气）流速：12 L/min；碰撞能量梯度：10、20、40 eV，一级质谱扫描范围：m/z100～1 000，二级质谱扫描范围：m/z50～1 000。

2 结果与讨论

2.1 UPLC－Q－TOF MS指纹图谱的建立

2.1.1方法学考察指标的确定前期研究发现，负离子模式下检出成分较正离子模式多［10］，因此本实验采用ESI源在负离子模式下采集数据。为使建立的指纹图谱科学、可靠，选择色谱响应较好且具代表性的活性成分圣草次苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、柠檬苦素和诺米林酸为指标，用于指纹图谱方法学验证，验证内容包括精密度、重复性、稳定性。

2.1.2精密度取同一批生广佛手供试品溶液，连续进样6次，计算上述5种选定指标的色谱峰保留时间及峰面积的相对标准偏差（RSD）。结果显示，所有参考指标保留时间和峰面积的RSD分别为0.010%～0.21%和0.37%～3.3%。将6次采集数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件（简称相似度评价软件）进行相似度评价，结果均大于0.99。以上结果表明仪器的精密度良好，符合广佛手指纹图谱建立的要求。

2.1.3重复性称取6份同一批号的生广佛手，制备6份平行样品，依次进样分析，计算选定指标对应色谱峰保留时间及峰面积的RSD。结果显示，所有参考指标保留时间和峰面积的RSD分别为0.010%～0.19%和0.93%～4.6%。将6次采集数据导入相似度评价软件进行相似度评价，结果均大于0.99。以上结果表明该方法的重复性良好，符合广佛手指纹图谱建立的要求。

2.1.4稳定性制备1份样品溶液，分别在0、2、4、8、12、18、24 h时进样分析，记录色谱图，并计算选定指标对应色谱峰保留时间及峰面积的RSD。结果显示，所有参考指标保留时间和峰面积的RSD分别为0.050%～0.17%和3.5%～6.3%。将7次采集数据导入相似度评价软件进行相似度评价，结果均大于0.99。以上结果表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好，符合广佛手指纹图谱建立的要求。

2.2 生、制广佛手的化学成分

按照“1.3.3”与“1.3.4”的色谱与质谱条件对标准品溶液、生广佛手及制广佛手样品溶液进行分析，其负离子模式下的总离子流图见图1。通过分子离子峰精确质量数、二级谱图等信息，结合文献［9－11］与化合物数据库，对样品中37个成分进行鉴定，包括：10个黄酮及黄酮苷类、4个香豆素类、12个有机酸类、5个糖苷类、2个柠檬苦素类及4个其它类（见表2）。其中，圣草次苷可抑制氧化应激、炎症反应及降血脂［12］；柠檬苦素类化合物具有抑制乳腺癌细胞的潜力［13］；橙皮苷为《中国药典》规定的广佛手指标成分［1］，具有抗炎、抗氧化及抗癌功效［14］。

表2 生、制广佛手化学成分的质谱数据及鉴定结果Table 2 Mass spectrometric data and the identification results of constituents in raw Fingered Citron and processed Fingered Citron

图1 生广佛手（A）、制广佛手（B）甲醇提取物及标准品溶液（C）的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of UPLC－Q－TOF MS for methanol extraction of raw Fingered Citron（A），processed Fingered Citron（B）and standard solution（C）

（续表2）

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1生广佛手指纹图谱的建立利用Qualitative Analysis B.07.00软件对11批生广佛手的UPLCQ－TOF MS质谱数据进行处理，提取并积分总离子流（TIC）图，导出色谱峰峰面积、峰高和保留时间等信息，建立相似度评价软件识别的.txt格式数据文件，导入评价软件，建立生广佛手的UPLCQ－TOF MS指纹图谱（图2A），并生成对照谱图（图2B）。指纹图谱的相似度结果均大于0.96，表明11批次生广佛手的相似度较好。相似度评价软件自动识别出24个共有峰，通过分子离子峰精确质量数、二级谱图等信息，结合文献、化合物数据库与对照品验证，鉴定出以下19个成分：S1、S2、S3为1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或异构体，S6为金圣草素-6，8-葡萄糖苷，S7为圣草次苷，S8为6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸，S9为3-羟基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸，S10为橙皮苷，S11为水合氧化前胡素，S12为橙皮素，S14为3，5，6-三羟基-3′，4′，7-三甲氧基黄酮或异构体，S15为柠檬苦素，S17为诺米林酸，S18为3，5，6-三羟基-4′，7-二甲氧基黄酮或异构体，S20为α-亚麻酸，S21为甲氧基-十五烷酸，S22为油酸，S23为棕榈酸，S24为十八烷酸（见表2）。

图2 生广佛手药材的指纹图谱（A）与对照指纹图谱（B）Fig.2 Fingerprint（A）and reference fingerprint（B）of raw Fingered Citron the number denoted were the same as those in Table 2

2.3.2制广佛手指纹图谱的建立将11批制广佛手的UPLC－Q－TOF MS质谱数据按照“2.3.1”方法操作，建立制广佛手的UPLC－Q－TOF MS指纹图谱（图3A），生成对照谱图（图3B），得到相似度均大于0.96，表明11批次制广佛手的相似度好。制广佛手的UPLC－Q－TOF MS指纹图谱中有22个共有峰，通过裂解规律推断、数据库匹配、参考文献与对照品验证，鉴定出以下14个成分：Z1为1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或异构体，Z2为3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯，Z3为圣草次苷，Z4为橙皮苷，Z5为水合氧化前胡素，Z9为3，5，6-三羟基-3′，4′，7-三甲氧基黄酮或异构体，Z10为柠檬苦素，Z12为诺米林酸，Z13为3，5，6-三羟基-4′，7-二甲氧基黄酮或异构体，Z16为葡萄内酯，Z19为α-亚麻酸，Z20为油酸，Z21为棕榈酸，Z22为十八烷酸（见表2）。

图3 制广佛手药材的指纹图谱（A）与对照指纹图谱（B）Fig.3 Fingerprint（A）and reference fingerprint（B）of processed Fingered Citron the number denoted were the same as those in Table 2

生、制广佛手的UPLC－Q－TOF MS指纹图谱中，共检出成分有11个，分别为：1-O-（3-丁烯基）-6-O-α-L-阿拉伯糖基-β-D-吡喃葡萄糖苷或异构体、圣草次苷、橙皮苷、水合氧化前胡素、3，5，6-三羟基-3′，4′，7-三甲氧基黄酮或异构体、柠檬苦素、诺米林酸、α-亚麻酸、油酸、棕榈酸和十八烷酸。表明广佛手生品与制品的指纹图谱较为相似。未同时检出的成分有7个，分别为：S6（金圣草素-6，8-葡萄糖苷），S8（6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸），S9（3-羟基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸），S12（橙皮素），S21（甲氧基-十五烷酸），Z2（3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯）以及Z16（葡萄内酯），可作为辅助鉴定生、制广佛手的成分。比较发现，生广佛手炮制后金圣草素-6，8-葡萄糖苷、6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸、3-羟基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸、橙皮素及甲氧基-十五烷酸在制广佛手中未检出，而是检出了3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯与葡萄内酯。其中，橙皮素可抑制黑色素瘤增殖，有抗肿瘤作用［11］，表明生广佛手炮制后的难挥发性化学成分发生变化，继而改变其功效。

2.4 化学模式识别分析

主成分分析（PCA）通过对高维数据降维，变换出重要的少数变量来反映整个样品的信息，可以清晰展示数据内的重复性与各组样本的差异性［14］。正交偏最小二乘法判别分析（OPLS－DA）对数据进行降维处理时引用了回归模型，可建立各数据与分组的关系，取得各组样本间的差异信息，还可对样本的分组进行预测。上述2种方法均可衡量各种成分表达模式对各组样本分类判别的影响强度和解释能力，从而辅助标志成分的筛选［15］。因此，利用UPLC－Q－TOF MS在正、负模式下采集数据，用SIMCA14.1软件对生、制广佛手进行PCA与OPLS－DA分析，研究广佛手炮制前后难挥发性成分的差异性。

2.4.1主成分分析将22批广佛手的数据经安捷伦Profinder 10软件进行处理，得到保留时间、精确质量数与响应度构成的数据文件，导入SIMCA14.1软件，在PCA－X模式下进行分析。从得分图（图4）看出，质控样（QC）聚集较好，表明方法稳定；制广佛手（Z）与生广佛手（S）样品分别沿t（1）或t（2）轴分开，说明广佛手炮制前后的化学组成存在差异；购于大参林药店的生广佛手与其制品在中心椭圆外，与集中购买的10批次样品不聚集，说明两种来源的广佛手存在差异，也证实了两者来源不同。

图4 样品的PCA-X模式得分图Fig.4 PCA-X scores of samples

2.4.2正交偏最小二乘法判别分析对生、制广佛手两组样品进行OPLS－DA分析，从得分图（图5A）可见，生广佛手与制广佛手聚类明显，两种模式下的Q2（cum）分别为0.966和0.985，表明模型的可预测准确程度分别为96.6%与98.5%，模型良好。

图5 OPLS－DA得分图（A）与模拟验证图（B）Fig.5 OPLS－DA model scores（A）and OPLS－DA model permutations（B）

通过置换检验，验证当前参数下OPLS－DA分析得到的模型是否过拟合。置换次数为200次的结果见图5B，其中虚线为模型所得回归线，左侧蓝色Q2值均低于右侧的Q2原始值，Q2散点所在回归线与左侧垂直轴交于零点以下，说明OPLS－DA原始模型有效，未出现过拟合。表明广佛手制品与其同源生品的化学成分存在显著性差异。

根据变量投影重要性VIP＞1与S-plots图中p（corr）＞0.58的标准筛选差异化合物，通过文献检索、数据库匹配及裂解规律，共鉴定出5个显著性差异成分，分别为：诺米林酸、5-异戊烯氧基-7-甲氧基香豆素、棕榈酸、油酸和水合氧化前胡素（见表3）。

表3 显著性差异成分Table 3 Significant difference ingredients

比较发现，上述成分在广佛手的生品与制品中均有检出，但含量存在差异，将它们各自在制品与生品中的峰面积进行对比，得到成分含量对比倍数（Fold change，FC），见表3。由表3可见，广佛手炮制后，差异性成分的含量普遍增加，5-异戊烯氧基-7-甲氧基香豆素增加最明显（FC=29.11），其炮制后的含量约提高29倍。研究发现，5-异戊烯氧基-7-甲氧基香豆素具有在体内外抑制肿瘤的活性［16］，水合氧化前胡素（FC=1.34）可抑制细胞凋亡，具有抗炎功效［17］。因此，推测炮制后广佛手的抗炎和抑瘤活性强度可能随着成分含量的变化而改变。

3 结 论

本研究基于UPLC－Q－TOF MS技术在正、负离子模式下采集数据，根据分子离子峰精确质量数、二级谱图等信息，结合文献和化合物数据库，并经标准品验证共鉴定了生、制广佛手中37个化学成分，首次建立生广佛手与制广佛手的UPLC－Q－TOF MS指纹图谱。其中生广佛手指纹图谱有24个共有峰，鉴定出其中19个成分；制广佛手有22个共有峰，鉴定出其中14个成分。两种指纹图谱有11个共检出成分，说明两种指纹图谱存在一定相似性；同时指出可用于辅助区分两者的非共检出的7个成分：金圣草素-6，8-葡萄糖苷、6-（β-D-吡喃葡萄糖氧基）-7-甲氧基-5-苯并呋喃丙酸、3-羟基-2-甲氧基-5，6-二甲基-苯甲酸、橙皮素、甲氧基-十五烷酸、3-甲氧基-4-O-β-D-葡萄糖基苯甲酸乙酯、葡萄内酯。所建立的指纹图谱相似度均大于0.96，结果可靠，可用于广佛手的真伪鉴别和质量控制。结合化学模式识别方法，鉴定出生、制广佛手5个含量显著性差异成分，其中5-异戊烯氧基-7-甲氧基香豆素的FC值增加最为明显，可作为区分生、制广佛手的化学标志物。研究结果对生、制广佛手的质量控制及药效学研究具有一定参考意义。