酸枣仁总黄酮的制备及质量控制研究

王 爽,闫 艳(山西省中医院药剂科,太原 0300;山西大学中医药现代研究中心;通讯作者,E-mail:yanyan50@sxu.edu.cn)

酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子,用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等证[1],具有镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑、抗氧化等广泛的药理活性[2]。在各类治疗失眠的中药制剂中,酸枣仁是最常用的组分。酸枣仁化学成分较清晰,迄今国内外学者已从酸枣仁中分离鉴定出131余种化合物种。黄酮是酸枣仁中含量高且具有活性的一类成分[3]。赵启铎等[4]采用小鼠强迫游泳实验和悬尾实验等抑郁模型表明酸枣仁黄酮具有抗抑郁活性。Liu等[5]研究表明酸枣仁中主要的黄酮类成分斯皮诺素具有焦虑样作用,其作用机制与调节GABAA和5-HT1A受体有关。因此有必要制备纯度高的酸枣仁总黄酮,并建立一种灵敏、高效和准确的含量测定方法用于酸枣仁的质量控制,为从酸枣仁总黄酮研发具有改善睡眠、抗焦虑等作用的药效成分提供物质基础。

超高效液相色谱-四极杆/线性离子阱串联质谱(UPLC-QTRAP-MS)技术是研究中药复杂成分的一种有效、可行的分析方法。其多反应监测-触发增强-子离子扫描(MRM-IDA-EPI)扫描模式,可以实现一次进样,得到用于定量的MS色谱图和用于定性的高质量的MS2质谱图,大大排除了假阳性结果[6],适合于中药复杂体系化学成分的定性和定量分析。本实验首先采用正丁醇萃取与大孔树脂相结合的方法提取纯化制备酸枣仁总黄酮;其次,建立基于MRM-IDA-EPI模式的LC-MS/MS定性和定量分析当药黄素、维采宁Ⅱ、牡荆素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、斯皮诺素、异牡荆素、6‴-阿魏酰斯皮诺素和芦丁的方法,并应用于酸枣仁总黄酮中7种成分的含量测定,为后期药效学和药动学研究提供实验基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1290超高液相色谱系统,包括四元输液泵,自动进样器等(美国Agilent公司);3200Q-Trap型质谱仪,配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.5.2数据处理软件(美国AB Sciex公司);CPA225D型十万分之一分析天平(德国Sartorius北京仪器系统有限公司);Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 材料

酸枣仁购于河北省安国市嘉润中药材有限公司,经山西中医药大学中药鉴定教研室杜晨晖教授鉴定为为鼠李科植物酸枣ZiziphsujujubeMill. var.spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的成熟干燥种子。

对照品当药黄素(批号20170216)、斯皮诺素(批号20160314)、6‴-阿魏酰斯皮诺素(批号20160313)均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司;山奈酚-3-O-芸香糖苷(批号6150)、维采宁Ⅱ(批号3922)均购于上海诗丹德生物技术有限公司;异牡荆素(Y-116-171222)购于成都瑞芬思生物科技有限公司;芦丁(批号C1424058)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司,以上对照品经HPLC归一化法测定质量分数均大于98%。甲醇、乙腈为色谱纯,均购于Fisher公司,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 酸枣仁总黄酮的制备

取酸枣仁药材约2 300 g,粉碎(过1号筛),加10倍体积石油醚浸泡过夜,加热回流提取2次,每次1 h,进行脱脂;滤过,药渣干燥并称重,加10倍体积70%乙醇浸泡4 h,加热回流提取2次,每次2 h,合并滤液,减压浓缩至无醇味,得浓度为1 g/ml(按生药量计)的浓缩液。浓缩液用水饱和正丁醇萃取4次(1 ∶1),合并萃取液,先减压浓缩,再水浴蒸制得浸膏,其得率为2.4%。

将浸膏用蒸馏水溶解至0.5 g生药/ml,上样到体积为2 L的D101大孔树脂上,分别用5倍柱体积(10 L)的水除去糖类等杂质、再用10%乙醇除杂、30%乙醇洗脱,收集洗脱液,蒸干(得率0.4%)。以斯皮诺素为对照,紫外分光光度法测定总黄酮纯度为58%。

2.2 供试品溶液的制备

称取酸枣仁总黄酮冻干粉约10 mg,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加70%甲醇10 ml,称定质量,超声处理20 min,放置室温,用70%甲醇补足减失的重量,滤过,取续滤液,即得。

2.3 对照品溶液的制备

取对照品适量,精密称定,加70%的甲醇制备成斯皮诺素和6‴-阿魏酰斯皮诺素浓度为1 mg/ml的单一对照品储备液,加70%的甲醇制备成当药黄素、维采宁Ⅱ、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异牡荆素、芦丁浓度均为0.05 mg/ml的单一对照品溶液,分别精密吸取上述对照品储备液适量加甲醇制成混合对照品储备液。

2.4 色谱及质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描模式:MRM负离子扫描;源喷射电压(IS)为-4 500 V;雾化温度:550 ℃;气帘气(Curtain gas,N2):40.0 psi;雾化气(GS1,N2):50 psi;辅助气(GS2,N2):50 psi。MRM-IDA-EPI模式:IDA参数:Select 1 to 1 most intense peaks;选择动态背景扣除(Alter Dynamic Background Subtraction of Survey scan);阈值(Which exceeds):500 cps;质量偏差(Mass Tolerance):250 mDa。EPI参数设置为扫描范围:50～950 Da;扫描速率(Scan rate):1 000 Da/s;离子阱动态填充(Dynamic fill time);DP:-60 V;EP:-10 eV;CES:( -40 ±10)eV。

2.5 提取溶剂的选择

以斯皮诺素和6‴-阿魏酰斯皮诺素2个黄酮类成分为指标,采用已建立的分析方法[7],分别比较了50%乙醇、60%乙醇和70%乙醇提取效果,结果显示,70%乙醇作为提取溶剂时,斯皮诺素和6‴-阿魏酰斯皮诺素的峰面积最高(见表1),因此,选择70%乙醇作为提取溶剂。

表1 提取溶剂的考察

2.6 定性和定量分析

按“2.4”项下色谱和质谱条件,分别对7个化合物进行增强子离子(EPI)参数的优化,获得高质量的二级碎片信息(见表2)。在负离子模式下,斯皮诺素失去C4H8O4(120 D)生成碎片离子m/z487或失去一分子葡萄糖(Glu)生成碎片离子m/z445(见图1)。m/z445进而失去一分子H2O生成m/z427,继而丢失C2H2O4生成碎片离子m/z337;碎片离子m/z427失去C4H8O4生成m/z307,并进一步失去CH3生成m/z292的碎片离子。当药黄素、维采宁Ⅱ、异牡荆素和6‴-阿魏酰斯皮诺素均为黄酮C糖,与斯皮诺素裂解方式相似,通过与对照品和文献比对,进行鉴别[7]。山奈酚-3-O-芸香糖苷和芦丁均为氧糖,均直接脱掉糖,生成相应的苷元(见图1)。

在化合物鉴定的基础上,对7个进行定量分析,7个成分的MRM色谱图见图2。

表2 七种成分的保留时间和质谱分析参数

2.7 方法学考察

2.7.1 线性关系考察 精密量取上述混合对照品溶液适量,用70%甲醇逐级稀释成含有当药黄素浓度为0.025,0.2,0.4,0.6,0.8,1 μg/ml,维采宁Ⅱ浓度为0.125,1,2,3,4,5 μg/ml,山奈酚-3-O-芸香糖苷浓度为0.04,0.8,1.6,2.4,3.2,4 μg/ml,斯皮诺素浓度1,12,24,36,48,60 μg/ml,异牡荆素浓度为0.05,0.2,0.4,0.6,0.8,1 μg/ml,6‴-阿魏酰斯皮诺素浓度为1.5,6,12,18,24,30 μg/ml,芦丁浓度为0.05,0.4,0.8,1.2,1.6,2 μg/ml的混合对照品溶液。按“2.4”项下色谱和质谱条件分析,以指标成分的峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X),进行线性回归,得回归方程、相关系数(r)和线性范围,结果7种指标成分的质量浓度和峰面积的相关系数均大于0.999 5(见表3),表明该方法线性关系良好。

2.7.2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液2 μl,按“2.4”项下色谱和质谱条件重复进样6次,考察仪器日内精密度。同一混合对照品溶液连续进3 d,计算仪器日间精密度,其峰面积的RSD值均小于3%(见表4),表明仪器精密度良好。

2.7.3 稳定性试验 取同一批酸枣仁总黄酮粉末样品,约4 mg,精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,于室温放置0,2,4,6,12,24 h后按色谱质谱条件进样,以峰面积进行分析,计算7种指标成分峰面积的RSD值,均小于3%(见表4),表明供试品溶液在24 h内稳定。

图1 MRM-IDA-EPI模式下酸枣仁总黄酮7种化合物定性EPI图谱Figure 1 EPI chromatograms of seven compounds of total flavonoids in Ziziphi Spinosae Semen under MRM-IDA-EPI mode

2.7.4 重复性试验 取同一批酸枣仁总黄酮样品粉末6份,每份约4 mg,精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4”项下色谱和质谱条件进样分析,分别记录7种指标成分当药黄素、维采宁Ⅱ、牡荆素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、斯皮诺素、异牡荆素、6‴-阿魏酰斯皮诺素,芦丁的峰面积,计算其质量分数分别为0.20%,0.97%,0.03%,1.3%,21.4%,0.19%,7.6%,0.4%,其RSD结果均小于3%(见表4),表明提取方法的精密度良好。

图2 对照品和酸枣仁总黄酮样品的MRM定量离子对色谱图Figure 2 MRM quantitative ion pair chromatograms of reference substance and total flavonoids

表3 七种成分的回归方程、相关系数、线性范围

表4 七种成分的精密度、稳定性、重复性 (%)

2.7.5 加样回收率试验 称取已知7个成分含量的酸枣仁总黄酮样品6份,每份约2 mg,分别精密加入与样品中7种成分含量相当的混合对照品溶液,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4”项下色谱和质谱条件进样分析,记录指标成分的峰面积,计算其平均加样回收率及相应的RSD值。当药黄素、维采宁、牡荆素、山奈酚-3-O-芸香糖苷、斯皮诺素、异牡荆素、6‴-阿魏酰斯皮诺素、芦丁的平均回收率分别为97.92%,95.87%,102.32%,106.11%,101.23%,97.45%和92.03%;RSD值分别为2.53%,2.68%,1.52%,1.91%,1.65%,2.64%和2.75%,表明提取方法的准确度良好。

2.7.6 样品测定 取制备的3批样品,按照“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.4”项下色谱和质谱条件进样分析,当药黄素、维采宁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、斯皮诺素、异牡荆素、6‴-阿魏酰斯皮诺素和芦丁的平均含量分别为(1.95 ±0.05)mg/g,(9.66 ±0.18)mg/g,(12.71 ±0.15)mg/g,(214.35 ±1.66)mg/g,(1.86 ±0.05)mg/g,(78.02 ±1.21)mg/g和(3.98 ±0.10)mg/g。由此可见,酸枣仁总黄酮的提取制备工艺稳定,样品含量稳定可控。

3 讨论

黄酮类化合物是酸枣仁的主要活性成之一。斯皮诺素及6‴-阿魏酰斯皮诺素作为主要的黄酮类成分,具有镇静催眠、抗抑郁、抗焦虑、抗氧化以及提高记忆力等功效的作用[8]。此外,研究表明当药黄素有改善认知功能[9],维采宁Ⅱ具有抗前列腺癌的作用[10];异牡荆素具有抗氧化、抗菌和调节记忆等功能[11]。黄酮氧糖山奈酚-3-O-芸香糖苷对缺血性脑梗塞具有潜在的治疗作用,并对神经细胞具有一定的保护作用[12];芦丁具有抗氧化及抑菌等作用[13]。本研究以酸枣仁总黄酮为研究对象,首先对制备酸枣仁总黄酮的最佳提取溶剂、萃取剂及纯化洗脱梯度进行了考察,70%乙醇作为提取溶剂时,两个主要化学成分斯皮诺素及6‴-阿魏酰斯皮诺素的峰面积较高,因此,选择70%作为提取溶剂。进而采用水饱和正丁醇作为萃取剂,并收集30%乙醇洗脱部位,最终得到百分含量为58%的酸枣叶总黄酮。

酸枣仁总黄酮中含有大量的同分异构体[2]。参考课题组前期分析酸枣仁的色谱条件[14],并在此基础上进行优化,实现了对当药黄素和异当药黄素、斯皮诺素和异斯皮诺素、木荆素和异牡荆素三对同分异构体的分离,为各成分的精确定量提供了前提。其次,利用针泵进样优化了当药黄素、维采宁Ⅱ、山奈酚-3-O-芸香糖苷、斯皮诺素、异牡荆素、6‴-阿魏酰斯皮诺素和芦丁7个对照品并MRM质谱条件。分别优选了最佳定量离子对,并考察了定量离子对的最佳去簇电压(DP)及碰撞能量(CE)。当MRM信号低于IDA设定的阈值500 cps时,只进行MRM扫描;当MRM信号大于IDA设定的阈值500 cps时同时启动线性离子阱的EPI功能。为了得到丰富的二级碎片信息,继而对EPI参数进行优化,结果表明,当EPI中DP为-60 V、CES为(-40 ±10)eV时,7个化合物的碎片离子最丰富。

本研究制备了纯度为58%酸枣仁总黄酮提取物;建立了一种能同时定性和定量7个黄酮的LC-MS/MS分析方法。该方法重复性好、分析速度快,准确度高,可应用于酸枣仁总黄酮定性定量分析,为后期药效学和药动学研究提供了稳定、可控的物质基础。