右美托咪定对大鼠脊髓神经元酸敏感性离子通道和α2A受体的影响

汪 静,项金慧,周亚兰(上海中医药大学附属曙光医院麻醉科,上海 201203;通讯作者,E-mail:zhouio11601@126.com)

右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)是一种高选择性的α2-肾上腺素能受体(α2-adrenergic receptors,α2-ARs)激动剂,具有镇静、镇痛、抗焦虑、交感神经及血流动力学稳定性,且过量服用也不会抑制呼吸,目前已广泛应用于临床[1,2]。右美托咪定的作用机制与疼痛信号通路中α2-AR的广泛分布有关,包括初级传入神经和脊髓背角,现已证实α2-ARs不仅可在全身给药时产生镇静及镇痛作用,还可通过硬膜外腔及周围神经周围给药产生镇静和镇痛作用[3,4]。除α2-ARs外,许多配体门控及电压门控离子通道也在背根神经节神经元等初级感觉神经元中表达,将有害刺激转化为上行伤害性信号[5],这些离子通道的调控可能是DEX抵抗外周伤害的潜在机制[5]。酸敏感离子通道(acid-sensing ion channels,ASICs)是配体门控离子通道,由细胞外质子直接门控,在神经系统中水平表达较高,负责产生酸诱发电流并充当pH传感器,导致神经元兴奋,在痛觉、恐惧行为等方面起着重要作用[6,7]。ASIC,尤其是ASIC3,是酸中毒所致相关疼痛的主要参与者,与患者疼痛相关,提示ASICs有可能成为镇痛药的潜在作用靶点[8]。而α2-ARs和ASICs都存在于背根神经节神经元中,二者间可能存在某种相关性。本实验通过研究ASICs是否参与了右美托咪定调节疼痛的过程,并对α2-ARs与ASICs间的关系进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞培养

选取7～8周龄的SD大鼠24只,体质量260～320 g。麻醉后脱颈、断头处死,取出胸腰段脊柱,将其迅速转移至解剖液中,置于4 ℃环境下保存,并用手术剪将神经节剪碎成肉糜状,转移到含有细胞培养液的试管中(细胞培养液中含有1.0 mg/ml的胶原酶、0.5 mg/ml的胰蛋白酶及0.1 mg/ml的脱氧核糖核酸酶Ⅰ,并添加1.25 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶的消化作用),在35 ℃环境下振荡并培养25～30 min。然后用Pasteur管轻轻吹打以分散细胞,将分散后的细胞悬液转移至10 ml的离心管中,置于含有10%胎牛血清及100 ng/ml的生长因子的培养基中培养12～24 h(37 ℃下,95% O2及5% CO2环境下)。

1.2 全细胞膜片钳记录及数据采集

1.2.1 全细胞膜片钳记录方法 使用EPC-10膜片钳放大器及PULSE软件(HEKA Electronic,Lambrecht,德国)在22～25 ℃的室温下进行全细胞膜片钳记录,将分离的脊髓神经元转移至35 mm的培养皿中,在记录电生理前将脊髓神经元于含150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、2.5 mmol/L CaCl2、10 mmol/L HEPES及10 mmol/L d-葡萄糖的500 ml正常外部溶液中停留至少60 min,用NaOH调节其pH值至7.4,用蔗糖溶液调节其渗透压至330 mOsm/L。使用Sutter P-97拉拔器(Sutter Instruments,CA,美国)拉动记录移液器,其电阻在3～6 MΩ范围内,通过微操纵器控制电极使封接电阻达GQ后,轻施负压使细胞破膜,调节相应电容补偿,即可获得全细胞模式。在实验全程中,细胞均钳制在-60 mV电压下,在电压钳模式下形成稳定的全细胞配置后,通过切换到电流钳模式获得电流钳记录,采集10 kHz记录电流,并过滤2 kHz电流,使用pCLAMP10软件进行数据检测及分析,选择直径为15～35 μm的神经元用于记录电生理,且本研究仅使用具有稳定静息膜电位(比-50 mV更负)的细胞。

1.2.2 右美托咪定对ASICs介导的酸诱导电流的调制作用的研究 选择直径在15～30 μm的大鼠脊髓神经元采用全细胞膜片钳技术记录电流,将其随机分为酸溶液组、右美托咪定组及右美托咪定+酸性溶液组。右美托咪定组单独予0.1 μmol/L右美托咪定,观察是否有电流引出。右美托咪定+酸性溶液组在实验中加入右美托咪定处理5 min后,再加入酸性溶液,使其pH约4.5时,并再次观察是否有电流引出。酸溶液组仅含有10 mmol/L的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶液,且pH为4.5,观察是否有电流引出。并在所有组别的细胞外液中加入瞬时感受器香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)阻断剂香草素受体亚家族拮抗剂(Capsazepine,CPZ),以排除TRPV1介导的酸诱导电流对实验的干扰。

1.2.3 不同浓度右美托咪定对大鼠脊髓神经元ASICs电流的调制效果 将pH 4.5时ASICs介导的脊髓神经元电流幅度作为对照组,观察右美托咪定浓度从0.1 μmol/L逐渐增加到10 μmol/L时其作用效果。不同浓度右美托咪定量效曲线用Hill方程拟合:I/I50=[1+(C/C50)n]-1,n为Hill系数,C50为半数有效时药物浓度。

1.2.4 不同pH时右美托咪定对ASICs电流峰值幅度的影响效果 比较不同pH值(6.5,5.5,4.5)时0.1 μmol/L右美托咪定对脊髓神经元酸敏感离子通道的抑制作用,并分析α2A受体在右美托咪定调节酸敏感离子通道中的作用。电流抑制率(%)=(对照ASICs电流幅值-药物作用时ASIC电流幅值)/对照ASIC电流幅值×100%。

1.2.5 α2A受体与右美托咪定在调节ASICs电流时的关系 向0.1 μmol/L右美托咪定预处理过的pH为4.5的酸溶液脊髓神经元细胞(0.5 ml)中加入α2A受体拮抗剂育亨宾,观察ASICs电流情况,分析α2A受体在右美托咪定调节酸敏感离子通道中的作用。

1.3 药物及试剂

本实验中涉及的药物:0.1 μmol/L盐酸右美托咪定(2 ml:200 μg/支,江苏恒瑞医药股份有限公司,国药准字H20090248)、98%育亨宾(20 mg/支,成都格利普生物科技有限公司)。实验浓度的药物在正常外部溶液中新鲜制备,并用NaOH将其pH调至7.4。药物出口与记录的神经元之间的距离约为30 μm。为了确保药物注入细胞内部,整个细胞通路的建立和电流测量之间至少间隔30 min。为了在功能上评估ASICs活性,采用CPZ(5 μmol/L)来阻断细胞外溶液中的瞬时感受器香草酸受体1(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 右美托咪定对大鼠脊髓神经元上ASICs介导的酸诱导电流的调制作用

单独应用右美托咪定时未能引出电流;当预先在实验中加入右美托咪定处理5 min后,再次加入酸性溶液,使其pH约4.5时,右美托咪定使S型电流峰值减少(37.1 ±4.9)%;F型电流峰值减少(35.2 ±5.1)%;B型电流峰值减少(38.1 ±6.2)%(见表1)。

表1 右美托咪定对ASICs介导电流的抑制作用

2.2 不同浓度右美托咪定对ASICs电流的调制作用

随着预处理右美托咪定的浓度从0.1 μmol/L增加到10 μmol/L,pH 4.5的电流峰值幅度逐渐降低(见图1)。将不同浓度右美托咪定对ASICs介导电流的抑制率进行拟合,经拟合计算得到右美托咪定抑制ASICs介导电流的半数最大有效浓度为(1.18 ±0.11)μmol/L。

2.3 不同pH值的酸性环境下右美托咪定对ASICs电流峰值幅度的影响

未加入右美托咪定时,不同pH环境下的电流峰值幅度间无明显差异(F=1.533,P>0.05);在用右美托咪定预处理(3 μmol/L,2 min)后,pH 6.5、pH 5.5及pH 4.5时所有ASICs介导的电流峰值振幅均较处理前降低(均P<0.05),但不同pH环境下的电流峰值幅度间无明显差异(F=1.848,P>0.05,见表2)。

图1 不同浓度右美托咪定对ASICs介导电流的抑制作用 Frgure 1 The inhibitory effect of different concentrations of dexmedetomidine on ASICs-mediated conduction current

表2 不同pH值的酸性环境下右美托咪定对ASICs电流峰值幅度的影响

2.4 α2A受体与右美托咪定调节ASICs电流的关系

经过右美托咪定预处理的pH4.5时ASICs介导电流的振幅降低了(41.23 ±5.47)%,但应用育亨宾与右美托咪定竞争阻断α2A受体后,pH4.5时电流峰值的振幅仅仅下降了(7.03 ±2.15)%(P<0.01,见图2),结果显示育亨宾能阻断右美托咪定对ASICs电流的调节作用,提示右美托咪定可能主要系通过调节脊髓神经元中的α2A受体,从而抑制ASICs电流。

与右美托咪定组比较，* * *P<0.001图2 右美托咪定与育亨宾抑制ASICs介导电流的关系Figure 2 The function of dexmedetomidine in yohimbine inhibiting ASICs-mediated conduction current

3 讨论

右美托咪定可通过激活中枢神经系统及脊髓α2受体,从而起到交感阻滞、镇静和镇痛的作用。α-2受体有3个亚型(α-2A、α-2B及α-2C),右美托咪定对可与神经系统中α-2A受体高度结合,从而发挥镇静、镇痛等作用[9,10]。ASICs是目前已经公认的外周神经伤害性受体,参与机体缺血、炎症及酸中毒等病理过程,形成或调制机体机械感觉,除此之外,ASICs作为皮肤、肌肉等组织的疼痛感受器,在痛觉中也发挥着作用[11]。α2-ARs及ASICs都存在于脊髓神经节神经元中,且都与疼痛的调制相关,二者间可能存在某种联系,但目前α2-Ars与ASICs间的相关性研究不慎明了,故本试验基于此,对ASICs在右美托咪定镇痛中的作用机制及α2-Ars与ASICs间的关系进行初步研究。

本实验通过研究右美托咪定对ASICs的影响及α2-ARs与ASICs间的关系,结果显示,右美托咪定能降低酸性环境下大鼠脊髓神经节神经根中由ASIC介导的电流幅度,在全细胞膜片钳实验中,在细胞外液中加入能特异性阻断TRPV1的CPZ,右美托咪定仍能抑制电流产生,表明大鼠脊髓神经节神经元上的ASICs可能是右美托咪定产生镇痛作用的相关靶点。ASICs主要是质子门控阳离子通道,当细胞外pH值降至7.0以下时被激活,在pH值处于生理正常值期间,其由非质子配体触发[12]。该通道是酸激活反应及酸中毒引起的中枢及外周神经系统生理变化的重要介质,ASIC1b主要存在于外周感觉神经元中,功能性ASIC1b在外周伤害感受和疼痛中发挥作用[13,14]。在术后疼痛等某些病理性疼痛情况下,质子释放导致体内pH值降低,呈现出酸性环境,且这种pH值的降低会持续数天,目前已有相关研究表面,发现含有ASIC3的外周通道可检测出pH值发生变化并可导致术后疼痛,而术中应用ASIC3抑制剂能有效的镇痛[15,16]。且随着右美托咪定的浓度不断增加,其对ASICs介导的电流的抑制作用不断加强,表明右美托咪定可能系通过跨膜信号传导途径抑制电流,或通过结合ASICs从而起到变构调节的作用。

当向经右美托咪定预处理过的神经元培养液中加入育亨宾后,右美托咪定对ASICs介导电流的抑制效果下降,而育亨宾为α2A受体拮抗剂,提示右美托咪定可能系通过激动α2A受体,从而抑制ASICs介导电流。此外,通过对不同pH值环境下右美托咪定对ASICs介导的电流抑制情况进行分析显示,不同酸性环境下,右美托咪定对ASICs的抑制效果相似,并无明显差异。提示右美托咪定抑制了ASICs对质子的最大反应,但质子敏感性没有变化。但值得一提的是,ASCIs只是痛觉感受器的一部分,即使将ASIC基因完全敲除,也不能将任何一种形式的痛觉完全去除掉[17,18]。

综上,右美托咪定对于脊髓神经节神经元的镇痛作用机制可能系通过激动α2A受体从而抑制酸性环境下ASICs介导的电流,从而起到镇痛的作用,为镇痛药的作用机制及作用靶点提供了新的研究方向。本实验存在不足之处为:样本容量较少,故具有一定局限性;本实验并未研究ASICs调控的具体蛋白,故应对其作用机制及作用靶点进行深入研究,以便为治疗提供新思路及新方向。