STAT3抑制剂LL1增强结直肠癌对5-FU的敏感性

马 亮,孙一鸣,张语涵,王若澜,孔令提,刘 哲(蚌埠医学院第一附属医院药剂科,蚌埠 33004;蚌埠医学院药学院;通讯作者,E-mail:liuzhe@bbmc.edu.cn;共同通讯作者,E-mail:875368@qq.com)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的胃肠道恶性肿瘤,据国际癌症研究机构编制的癌症发病率和死亡率统计,结直肠癌发病率在全球范围内排名第五(10.0%)、致死率排名第五(9.4%)[1]。

信号转导及转录激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3, STAT3)是信号转导和转录激活子家族(signal transduction and activator of transcription,STATs)的成员之一,能够参与细胞增殖、分化和凋亡,调节血管生成等生物活动,具有多种重要的生物功能[2]。STAT3在正常生理条件下短暂激活,能够调节一系列细胞生物学过程[3]。然而,STAT3在肿瘤细胞中持续激活,影响肿瘤的发生和发展[4]。研究表明,STAT3参与肿瘤恶性转化的重要途径是作为转录因子,调节下游肿瘤相关基因表达[2]。此外,STAT3参与调控血管生成的关键步骤,STAT3高表达往往预示较差的预后以及较低的5年生存率[5]。因此,STAT3在肿瘤的发生发展中扮演了重要角色。

结直肠癌的主要治疗手段包括手术治疗和放化疗[6],目前公认的治疗方案为FOLFIRI(伊立替康、亚叶酸钙、5-氟尿嘧啶联用)、mFOLFOX6(奥沙利铂、四氢叶酸、5-氟尿嘧啶联用)、CapeOX(奥沙利铂、卡培他滨联用),配合手术治疗[7]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一种合成的氟嘧啶类似物,5-FU及其衍生物是临床上最常用的化疗药物。通过抑制结直肠癌细胞DNA合成和抑制胸苷酸合成酶活性发挥作用,5-FU可以改变结直肠癌细胞的主要细胞生物学功能(如凋亡、自噬、细胞周期等等)[8]。尽管5-FU能够在癌症早期治疗中起到较好的效果,但是长期使用5-FU会导致肿瘤耐药,且结直肠癌复发患者往往对5-FU敏感性不高[9]。耐药在很大程度上限制了5-FU的化疗效果,其治疗患者生存中位数约为20个月[10]。研究表明STAT3与结直肠癌耐药性有相关性,并且高表达STAT3可导致结直肠癌细胞对5-FU敏感性降低。LL1是新型STAT3小分子抑制剂,通过计算机辅助药物设计,特异性靶向STAT3的SH2结构域。研究表明LL1具有很高的特异性和安全性[11],有望应用于结直肠癌的临床治疗。本研究通过5-FU与新型STAT3抑制剂LL1联用,观察其对于结直肠癌细胞生长的影响,以期对于LL1与5-FU联用治疗结直肠癌提供新的思路和科学依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

DMEM培养基购于Gibco公司;胎牛血清、Trizol购于南京迈克沃德生物公司;CCK-8试剂盒(碧云天C0038);Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于贝博公司(BB-4101);RIPA裂解液购于碧云天公司,STAT3、p-STAT3(tyr705)、Bcl-2、c-Myc、Survivin一抗购于武汉三鹰公司,二抗购于南京迈克沃德生物公司,LL1{4-((2-(piperazin-1-yl)phenyl)amino)-5H-naphtho[1,8-cd]isothiazol-5-one 1,1-dioxide},由中国药科大学余文颖课题组提供;人结直肠癌细胞株HT-29由蚌埠医学院第一附属医院郑海伦课题组提供。

1.2 细胞培养

HT29细胞使用含10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基在37 ℃,5%CO2培养箱中常规培养并传代。

1.3 PCR法检测基因表达

使用不同浓度LL1(2,4 μmol/L)处理HT-29细胞24 h,使用Trizol从细胞中分离总mRNA,使用Hiscrip Q RT SuperMix进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)合成cDNA,在安装有IQ5多色实时PCR检测系统的实时定量PCR仪上使用SYBR GREEN进行定量RT-PCR(qRT-PCR)分析,比较组间细胞c-Myc、Survivin和Bcl-2 mRNA表达水平。

1.4 CCK-8法测定细胞存活

使用CCK-8法测定细胞存活率,按照其说明书进行使用。体外培养结直肠癌HT-29细胞,取对数生长期的HT-29细胞使用胰蛋白酶进行消化,以5×103cells/孔的密度接种于96孔板中,每组设5个平行复孔。24 h后,观察细胞贴壁良好,密度适宜。对照组使用新鲜培养液,而实验组使用含药培养液处理,实验组浓度设置如下:LL1(0,1,2,4,6,8 μmol/L),5-FU(0,0.1,1,10,100,1 000 μmol/L),5-FU(0,0.1,1,10,100,1 000 μmol/L)+LL1(2 μmol/L),然后将其放回37 ℃,5%CO2培养箱孵育。24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液,于培养箱中孵育1 h,使用多功能酶标仪于450 nm波长处检测其吸光度A值,记录数据,使用空白孔调零,以对照组为100%,计算各组细胞存活率(细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%)。

1.5 集落克隆实验

体外培养结直肠癌HT-29细胞,取对数生长期的HT-29细胞使用胰蛋白酶进行消化,使用血细胞计数板法进行计数,随后稀释成所需浓度的细胞悬液,以2×103cells/孔的密度接种于6孔板中,待其贴壁后对照组使用新鲜培养液,而实验组使用含药培养液处理,实验组分别用0.8 μmol/L 5-FU或0.8 μmol/L 5-FU+0.1 μmol/L LL1处理,放置于培养箱中,15 d后使用显微镜观察其集落形成情况。弃去培养液后,使用PBS冲洗一遍。随后使用4%多聚甲醛进行固定0.5 h,弃去多聚甲醛,使用PBS冲洗一遍后,加入结晶紫染液染色0.5 h,弃去结晶紫,倒扣在纸上待其干后进行拍照,比较不同处理组集落形成能力差别。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

体外培养结直肠癌HT-29细胞,取对数生长期的HT-29细胞使用胰蛋白酶进行消化,使用血细胞计数板法进行计数,随后稀释成所需浓度的细胞悬液,以2×105cells/孔的密度接种于6孔板中,待其贴壁后对照组使用新鲜培养液,而实验组使用含药培养液处理,实验组分别用1 μmol/L 5-FU或1 μmol/L 5-FU+2 μmol/L LL1处理,放置于37 ℃,5%CO2培养箱中培养24 h后,PBS洗涤一遍后使用不含EDTA的胰酶进行消化,细胞悬液以1 000g,4 ℃离心5 min收集细胞,弃去上清,用冷PBS洗涤两次,用400 μl 1×Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×106cells/ml。按照说明书在细胞悬液中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC,轻轻混匀后于2～8 ℃避光条件下孵育15 min,加入5 μl PI后轻轻混匀于2～8 ℃避光条件下孵育5 min。在1 h内使用流式细胞仪检测,记录相关数据,比较不同组凋亡率。

1.7 Western blot法检测蛋白表达

体外培养结直肠癌HT-29细胞,取对数生长期的HT-29细胞使用胰蛋白酶进行消化,使用血细胞计数板法进行计数,随后稀释成所需浓度的细胞悬液,以2×105cells/孔的密度接种于6孔板中,待其贴壁后对照组使用新鲜培养液,而实验组使用含药培养液处理,实验组分别用1 μmol/L 5-FU或1 μmol/L 5-FU+2 μmol/L LL1处理,放置于37 ℃,5%CO2培养箱中培养24 h后,使用胰酶消化收集HT-29细胞,提取细胞总蛋白,BCA(bicinchoninic acid)法校正不同组别蛋白浓度,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis PAGE)后半干法转膜至PVDF膜;快速封闭液封闭30 min后4 ℃过夜孵育STAT3总蛋白,p-STAT3(tyr705)蛋白,Bcl-2,c-Myc,Survivn蛋白抗体,TBST洗膜15 min后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的二抗,孵育2 h。Bio-rad成像系统曝光。

1.8 数据处理

2 结果

2.1 LL1影响STAT3下游基因mRNA表达水平

RT-PCR检测结果表明,与0 μmol/L组相比,2,4 μmol/L LL1组结直肠癌HT-29细胞c-Myc,Survivin和Bcl-2 mRNA表达水平均显著下降(P<0.05,见表1)。

表1 RT-PCR检测LL1对c-Myc,Survivin和Bcl-2基因表达水平的影响

2.2 LL1增强5-FU对结直肠癌细胞存活的抑制作用

CCK-8结果显示,LL1可抑制结直肠癌HT-29细胞增殖(见表2)。与相应浓度的5-FU组相比,5-FU+LL1联用组结直肠癌HT-29细胞存活率明显降低(P<0.05,见表3)。

表2 不同浓度LL1对HT-29细胞存活的影响

2.3 LL1增强5-FU对结直肠癌细胞集落克隆形成的抑制作用

细胞集落克隆实验结果显示,与空白对照组相比,低浓度联用组和低浓度5-FU组集落数均显著减

表3 不同浓度5-FU单用及与LL1联用对HT-29细胞存活的影响

少(P<0.05),且低浓度联用组集落数小于低浓度5-FU组(P<0.05,见图1)。

与对照组相比,*P<0.05;与低浓度5-FU相比,#P<0.05图1 5-FU对HT-29细胞集落克隆形成的影响Figure 1 Effect of 5-FU on colony formation of HT-29 cells

2.4 LL1增强5-FU对结直肠癌细胞诱导凋亡的作用

PI/Annexin Ⅴ双染实验显示,与对照组相比,高浓度联用组和高浓度5-FU组细胞凋亡率均显著增加(P<0.05),且高浓度联用组凋亡率大于高浓度5-FU组(P<0.05,见图2)。

与对照组相比,*P<0.05;与高浓度5-FU组相比,#P<0.05图2 LL1增强5-FU诱导HT-29细胞凋亡的能力Figure 2 LL1 enhances the induction of 5-FU to apoptosis of HT-29 cells

2.5 LL1与5-FU联用抑制STAT3及下游蛋白表达水平

Western blot检测结果表明,与高浓度5-FU组相比,高浓度联用组p-STAT3及下游蛋白c-Myc,Survivin和Bcl-2表达水平均显著下降(P<0.05,见图3)。

与高浓度5-FU组相比,#P<0.05图3 Western blot检测LL1与5-FU联用对STAT3及下游蛋白表达水平的影响Figure 3 The effect of LL1 combined with 5-FU on the expression of STAT3 and downstream proteins by Western blot

3 讨论

近年来,世界范围内结直肠癌发病率和致死率逐步攀升。数据调查显示,在欧美国家,结直肠癌是第三常见的癌症。而在亚洲国家,其发生率也在逐步上升。在中国,结直肠癌的发病率近十年几乎翻了一倍,其发病越来越趋向于低龄化、年轻化[12],约50%的结直肠癌患者在数年内死亡[13,14]。

结直肠癌常用的治疗方法有手术治疗、放疗、化疗等。其中,手术治疗对于早期患者有着较好的疗效,可以显著改善患者的生存质量[15]。然而,随着病程的进展,结直肠癌的治疗难度急剧上升,单一的手术治疗已难以达到令人满意的效果。此时,需要根据患者实际情况采用化疗、放疗联合手术治疗的综合治疗方法。5-FU作为最常见的结直肠癌化疗药物之一,拥有良好的治疗效果。其作用机制包括干扰RNA的合成和功能,抑制胸苷酸合酶等。随着化疗的深入,耐药性的产生不可避免。5-FU的耐药机制较为复杂,耐药性会限制化疗效果,最终导致治疗失败[16]。

STAT3是STATs蛋白家族成员之一,参与细胞的增殖分化、凋亡、侵袭迁移等等过程。在恶性肿瘤中,其最主要参与肿瘤发生发展的途径是作为转录因子参与调控下游肿瘤基因表达,同时参与血管基底膜重构[2]。研究发现,STAT3在神经胶质瘤、恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌以及前列腺癌等多种实体瘤组织与细胞中异常表达或活性增强[17]。研究表明,STAT3下游的Bcl-2、Survivn与结直肠癌产生的5-FU耐药性相关[18],且c-Myc基因与多种肿瘤发生发展有关[19]。在本研究中,我们分别使用了RT-PCR法以及Western blot法检测LL1对于结直肠癌HT-29细胞Bcl-2、c-Myc、Survivn mRNA表达情况的影响以及与高浓度5-FU组相比,LL1与5-FU联用对于STAT3以及其下游Bcl-2、c-Myc、Survivn蛋白表达情况的影响。结果表明,LL1可以抑制HT-29细胞Bcl-2、c-Myc、Survivn mRNA表达,且高浓度联用组相比较高浓度5-FU组,p-STAT3以及Bcl-2、c-Myc、Survivn蛋白表达均显著下降。同时,CCK-8法结果显示5-FU+LL1联用组对HT-29细胞增殖抑制较5-FU组较强,而集落克隆实验结果显示低浓度联用组较低浓度5-FU组集落数目显著减少。此外,Bcl-2是经典的抗凋亡基因,Cory等[20]报道,在许多肿瘤中存在Bcl-2的过度表达。在本研究中,我们进行了PI & Annexin Ⅴ双染实验,实验结果显示,高浓度联用组细胞凋亡率显著高于高浓度5-FU组,结合Western blot以及PCR结果,猜想可能是通过抑制STAT3进而抑制Bcl-2表达,从而促进细胞凋亡。因此,LL1可能通过抑制STAT3并影响其下游基因Bcl-2、c-Myc、Survivn等表达,从而实现增加结直肠癌HT-29细胞对5-FU的敏感性。

综上,本研究表明LL1可增加结直肠癌对于5-FU化疗的敏感性,其机制可能是抑制STAT3并影响其下游基因表达。本研究为临床治疗结直肠癌及逆转5-FU耐药提供新的思路。