细胞黏附分子2对非小细胞肺癌增殖、侵袭和凋亡的影响

苗 毅,段进进,尚立群,王 莉,吴 桦,董 玉(陕西省人民医院呼吸与危重症一科,西安 70068;西安市中心医院呼吸科;通讯作者,E-mail:proneduan@sina.com)

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因,其中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)所引起的死亡数占肺癌患者总死亡数的近80%[1,2]。手术切除是目前治疗肺癌的主要手段,但是根治性切除后5年生存率仅有30%～60%[3]。近年来,肺癌的分子靶标治疗已成为研究的热点。针对关键靶点的几种新药已经取得了较好的临床疗效[4]。然而,由于在患者中筛选合适的基因突变比较困难以及耐药性的发生,使得分子靶标治疗应用达到瓶颈[5]。因此,寻找新的参与肺癌发生发展的靶向分子并将其用于临床,对于肺癌患者的治疗具有重要意义。细胞黏附分子(cell adhesion molecules, CADMs)是一类位于细胞表面的蛋白质家族,包括CADM1、CADM2、CADM3和CADM4[6]。CADM2(也被称为Necl-3、cynCAM2、IGSF4D)与多种癌症有关,如乳腺癌[7]、前列腺癌[8]和鼻窦癌[9]。据报道,CADM2在多种癌症中缺乏或低表达,参与癌细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡过程[10,11]。有研究指出,CADM2可能与肺癌细胞的迁移和侵袭过程有关[12]。然而,CADM2在肺癌中的具体功能还需要进一步探究。本研究将对CADM2在肺癌细胞系A549和H460中的表达情况进行检测及分析,并探讨CADM2过表达对A549和H460体外生物学过程(增殖、侵袭以及凋亡)的作用及可能调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

人肺癌细胞系A549和H460(ATCC,美国),胎牛血清和DMEM(Gibco,美国),Lipofectamine 2000转染试剂盒、Trizol试剂(Invitrogen,美国),RNA逆转录试剂盒、cDNA合成试剂盒和qPCR定量试剂盒(Takara,美国),qPCR引物(上海生工生物工程技术服务有限公司),CCK-8(Dojindo Molecular Technologies,日本),BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒和ECL检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司),聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美国),anti-CADM2抗体(SAB4501053),anti-p-AKT抗体(05-802R)、anti-AKT抗体(SAB4500797)、anti-p-mTOR抗体(SAB5700327)、anti-mTOR抗体(AMAB91508)购自Merck公司(美国),anti-GAPDH抗体(SAB2108668)购自Sigma公司(美国),辣根过氧化物酶(HRP)二抗(南京钟鼎生物公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI双染试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司),Transwell小室(Corning,美国)。

1.2 细胞系培养和转染

人正常肺细胞系Gekko lung-1和非小细胞肺癌细胞系A549和H460分别培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,培养基另需加入100 U/ml青霉素G和100 μg/ml链霉素。将细胞置于含5% CO2、温度为37 ℃的培养箱中培养。

将A549和H460细胞分别接种于24孔板,密度为1×105个细胞/孔,待细胞汇合度达80%时,以Lipofectamine 2000试剂盒进行转染实验。将CADM2过表达质粒分别转染A549和H460细胞(pcDNA3.1-CADM2组),并且设置载体阴性对照组(pcDNA3.1-NC组)以及未处理空白对照组(control组),后续实验分组相同。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖

A549和H460细胞在转染1,2,3 d后,分别使用CCK-8试剂盒进行细胞活性检测。将10 μl CCK-8溶剂直接加入细胞中(100 μl/孔),并在37 ℃下培养4 h。用微孔板阅读器(美国BioRad公司)测量在450 nm处的吸光度(OD450)。

1.4 RT-qPCR检测CADM2、p-AKT、p-mTOR mRNA表达

Trizol法从Gekko lung-1、A549和H460细胞中提取总RNA,然后使用反转录试剂盒合成cDNA并根据qPCR试剂盒说明书进行CADM2转录水平的检测,比较在肺癌细胞和正常肺细胞中的CADM2 mRNA表达情况。此外,还通过检测CADM2的转录水平测定了pcDNA3.1-CADM2过表达质粒的转染效率。为了探究CADM2发挥作用的可能机制,本研究进一步在A549和H460细胞中研究了AKT/mTOR信号通路,进行了通路相关分子p-AKT、p-mTOR转录水平的检测。GAPDH作为内参基因。以2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。转录反应条件如下:95 ℃预变性3 min,然后进行热循环,在95 ℃下变性20 s,在60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共进行35个循环。引物由南京擎科生物科技有限公司合成,序列如下:CADM2上游引物为5′-GATCGGACTGCAGGAGCGAC-3′,下游引物为5′-TGTAGCAGCTCGAGTTCGAA-3′;p-AKT上游引物为5′-GGACAAGGACGGGCACATTA-3′,下游引物为5′-CGACCGCACATCATCTCGTA-3′);p-mTOR上游引物为5′-CTTATGGTGCGGTCCCTTGT-3′;下游引物为5′-GGTCACCTGAGGGTGAACTG-3′);GAPDH上游引物为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′;下游引物为5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.5 Western blot检测CADM2、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表达

RIPA缓冲液用于提取Gekko lung-1、A549和H460细胞的总蛋白,然后使用BCA法检测蛋白的总浓度。随后,使用12% SDS-PAGE凝胶分离蛋白并转移到PVDF膜上并且室温封闭3 h。分别用1 ∶500倍稀释的CADM2和1 ∶1 000倍稀释的p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH的一抗4 ℃孵育过夜。随后,在室温下用1 ∶5 000倍稀释的HRP偶联二抗孵育1 h。最后采用ECL检测试剂显影成像。GAPDH作为内部参照,根据各个条带的灰度值进行统计分析。

1.6 Transwell实验检测细胞侵袭

收集处理的或未处理的A549和H460细胞后分别用胰蛋白酶消化,接种Transwell小室于24孔板内,上室加100 μl细胞悬液(细胞密度为2×104个细胞/孔),下室加800 μl含10%胎牛血清的培养基,在37 ℃含5% CO2培养箱培养1 d后,取出小室,棉签擦去微孔膜上多余的细胞,PBS清洗小室一次后,然后在室温下用4%甲醛固定膜30 min,用0.1%结晶紫染色15 min。最后,显微镜下放大200倍并从10个不同的视野计算实验组及对照组的侵袭细胞数。

1.7 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡

A549和H460细胞按上述分组转染2 d后进行细胞凋亡检测。收集细胞并洗净后,使用Annexin Ⅴ-FITC双染色凋亡检测试剂盒染色,流式细胞仪进行细胞凋亡分析。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 CADM2在A549和H460细胞中低表达

RT-qPCR和Western blot实验结果表明,相对于正常肺细胞Gekko lung-1,在非小细胞肺癌细胞系A549和H460中CADM2 mRNA和蛋白表达水平明显下降,且差异有统计学意义(P<0.05,见图1)。

2.2 CADM2过表达抑制A549和H460细胞增殖

RT-PCR和CCK-8细胞增殖实验结果表明,转染pcDNA3.1-CADM2过表达质粒后CADM2在A549和H460细胞中显著上调,且过表达CADM2明显抑制了A549和H460的细胞增殖,抑制效果在3 d最好,差异具有统计学意义(P<0.05,见图2)。

与Gekko lung-1组相比,*P<0.05图1 CADM2在非小细胞肺癌细胞系中的表达量Figure 1 The expression levels of CADM2 in NSCLC cell lines

与control组及pcDNA3.1-NC组相比,*P<0.05图2 过表达CADM2对细胞增殖的影响Figure 2 The effect of CADM2 overexpression on cell proliferation

2.3 CADM2过表达抑制侵袭并促进凋亡

相比于对照组,过表达CADM2明显抑制A549和H460细胞侵袭的能力,差异具有统计学意义(P<0.05,见图3)。此外,过表达CADM2显著增加A549和H460细胞凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05,见图4)。

与control组及pcDNA3.1-NC组相比,*P<0.05图3 过表达CADM2对细胞侵袭的影响 (×400)Figure 3 The effect of CADM2 overexpression on cell invasion (×400)

图4 过表达CADM2对细胞凋亡的影响Figure 4 The effect of CADM2 overexpression on cell apoptosis

2.4 CADM2过表达抑制AKT/mTOR信号通路

RT-PCR和Western blot结果表明,与对照相比,CADM2过表达在A549和H460细胞中p-AKT和p-mTOR水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,见图5)。

3 讨论

尽管近年来手术、放射治疗和化学疗法取得了良好成效,非小细胞癌的预后仍然很差,这与它的恶性病理特征相关。目前,分子靶标治疗被认为是一种很有前途的治疗战略,并且急需新的、高效的分子靶点为非小细胞肺癌的治疗改善提供新的思路。因此,本实验探究了CADM2在非小细胞肺癌细胞系中的作用和潜在机制。本研究发现与正常肺细胞Gekko lung-1相比,在非小细胞肺癌细胞系A549和H460中CADM2表达水平明显降低。类似地,也有研究报道CADM2在其他癌症如肝细胞癌[13]和视网膜母细胞瘤[11]中表达量低于正常细胞。研究表明,表观遗传修饰可能是CADM2低表达的原因之一,如CADM2启动子的甲基化[14]。CADM2基因编码了两种同种型(CADM-2A和CADM-2B),每个同种型由独立启动子驱动。在前列腺癌样本组织及细胞中,CADM-2A启动子的高度甲基化可抑制CADM2的表达[15]。有趣的是,CADM2被报道在二氧化硅诱导的7 d肺损伤小鼠模型中上调[16]。以上数据表明CADM2的表达不具有组织特异性,可能在多个疾病进程中具有不同的生物学功能,并且提示CADM2的表达下调可能与启动子的甲基化相关,为进一步探究CADM2表达差异的机制提供重要的参考价值。

图5 过表达CADM2抑制AKT/mTOR信号通路的活化Figure 5 CADM2 overexpression inhibits the activation of AKT/mTOR pathway

CADMs是一个新发现的蛋白家族,被报道具有肿瘤抑制因子的功能,并且在多个正常组织中表达[17]。与CADM2属于同一家族的CADM1(也称为NECL-2、TSLC1、SYNCAM1、IGSF-4A)在肺癌[18]、前列腺癌[19]、和食管癌[20]中发挥抑癌作用。在前期研究中CADM2主要被认为是肥胖相关基因,参与细胞能量代谢过程[21]。近年来,越来越多的研究发现CADM2在多种癌症疾病中扮演着重要角色。据报道CADM2在多种癌症中均有表达,如乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤[7,22,23],并且可调控细胞的恶性进程,包括增殖、侵袭、抗凋亡等。研究表明,CADM2过表达可明显抑制肾癌和食管鳞状细胞癌细胞生长,诱导细胞凋亡[13,24]。此外,在肝细胞癌中,CADM2可抑制细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,ETC),并且它被认为是一个有吸引力的生物标志物,用于预测肝癌患者复发风险以及治疗筛查[25]。相似地,本研究发现CADM2过表达可有效抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡。基于本研究中的数据,CADM2被认为是一种新型的肿瘤抑制因子,可能成为非小细胞肺癌潜在的治疗靶点。

AKT是AGC(PKA/PKG/PKC)蛋白激酶家族的成员,可通过磷酸化激活下游蛋白激酶mTOR。AKT/mTOR通路是一种信号转导通路,通过响应细胞外信号调节细胞周期和抑制细胞凋亡[26]。据报道,AKT/mTOR的异常激活通常与肿瘤的恶性进程相关,如促进乳腺癌和前列腺癌的进展和转移[27]。此外,AKT/mTOR通路的上调也在很大比例的非小细胞肺癌患者中得到证实[28]。AKT/mTOR通路抑制剂已被确定为有希望的治疗方法,用于延迟非小细胞肺癌的进展和转移[29]。在非小细胞肺癌中,姜黄素和豆蔻素可下调p-AKT和p-mTOR的表达,并抑制癌细胞的增殖和侵袭,诱导细胞凋亡,提示靶向AKT/mTOR通路的分子可能是治疗非小细胞肺癌的有效靶点[30,31]。最近的一份报告显示,过表达CADM2可抑制食管鳞状细胞癌细胞中AKT通路的活化[13]。在本研究中,CADM2过表达抑制了A549和H460细胞中p-AKT和p-mTOR蛋白水平,说明CADM2过表达抑制了非小细胞肺癌细胞中AKT/mTOR信号通路的激活。值得注意的是,AKT/mTOR通路可与其他平行信号级联反应,因此,进一步探究CADM2在非小细胞肺癌中潜在的其他保护性作用具有重要意义。

综上所述,CADM2通过抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡来发挥抑癌作用,其机制是抑制AKT/mTOR信号通路的激活。因此,CADM2/AKT/mTOR轴可以作为一个潜在的靶点用于治疗非小细胞肺癌。