腺水螨属部分物种DNA条形码分析

张 旭，吴萍萍，王 琪，印海锋，宋绍萱

（淮北师范大学 生命科学学院，安徽 淮北 235000）

0 引言

腺水螨属Lebertia Neumank，1880隶属于蜱螨亚纲Acari，真螨总目Acariformes，绒螨目Trombidiformes，前气门亚目Prostigmata，大赤螨总股Anystides，寄殖螨股Parasitengonina，水螨亚股Hydrachnidiae，腺水螨总科Lebertioidea［1］.腺水螨属种类分布广泛，遍及各大地理区系的淡水水体中，是底栖节肢动物的重要组成部分.腺水螨的幼螨寄生于蚊、蠓等卫生害虫体表，影响寄主的生长发育甚至造成寄主死亡.因而腺水螨可以被用作害虫的生物防治［2］.目前世界已记录腺水螨种类300余种，但由于腺水螨属种类体型微小（0.5～2 mm），形态构造复杂，传统的形态学鉴定需要对螨体解剖，操作过程繁琐，不仅耗时较长，且对鉴定者的专业水平要求较高.

DNA条形码是Herbert在2003年提出的生物分子鉴定技术，该技术是利用生物体内线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ（Cytochrome c oxidase subunit I，COⅠ）基因序列的差异实现对物种的快速鉴定［3］.该技术对鉴定者的专业背景没有特别的要求，鉴定过程简单，省时.近年来DNA条形码技术在动物物种鉴定方面得到广泛发展，特别是体型较小，形态特征构造复杂，利用常规的形态学鉴定较为困难的无脊椎动物［4］.目前，国内外对于腺水螨属的研究多集中在形态分类上，而关于腺水螨属的分子鉴定技术还未曾有报道.本研究是以GenBank上获取腺水螨属的16个物种93条的COⅠ序列为研究材料，通过分子序列的分析，探究DNA条形码技术在腺水螨属鉴定中的可行性，为以后腺水螨属的快速鉴定提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料来源

在GenBank数据库中，以腺水螨属和COⅠ基因为关键词搜索，为提高数据的可信度，选择已经有文献支持并公开发表序列，剔除物种信息不明的种类（仅选择包含详细的种名和属名的物种）.最终下载腺水螨属16个物种93条序列（样品信息详见表1）［5-8］.

表1 样品信息

1.2 序列分析

用MEGA 7.0软件对93条COⅠ序列进行比对，将冗余序列删除，计算碱基组成、变异位点、保守位点、简约信息位点；运用DAMBE 6.4.67软件对序列饱和度进行分析，横坐标为TN93模型校正距离，纵坐标为碱基替代频率，进行散点分析；基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型计算种内、种间遗传距离；以Sperchonopsis ecphyma（Genbank登录号：MF124252）和Sperchon rostratus（Genbank登录号：MF124257）为外群选择邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，采用Bootstrap值进行1 000次重复检测验证树上各节点的支持率.运用ABGD软件，在一定的遗传距离范围内对样本进行划分.将93条COⅠ序列提交至ABGD网站，种内差异先验值P为0.001到0.1，最小相对gap宽度值X（minimum relative gap width）为0.6，steps值设为20.

2 结果与分析

2.1 碱基序列特征

使用MEGA 7.0软件对93条COⅠ序列进行比对后，最终保留608 bp的同源序列，序列中没有缺失或者插入的现象.T、C、A、G的平均含量分别为34.1%、18.9%、31.8%、15.2%，C+G的含量（34.1%）小于A+T的含量（65.9%），这与节肢动物序列特征相似，有明显的碱基偏好性.特别是在第3位密码子A+T含量高达85.2%，G含量的平均值仅有3.5%，C含量的平均值与A、T相比也较低，为11.3%.保守位点、变异位点和简约信息位点的含量为387个、221个、212个，在608 bp位点中分别占63.65%、36.35%和34.87%，变异位点大多数在第3核酸位点.

表2 16种腺水螨93条COⅠ基因序列碱基序列特征 %

2.2 碱基替换分析

应用MEGA 7.0软件进行碱基替换分析，在16种腺水螨的93条序列中，核苷酸替换多数为一致替换，为524个，转换数（S）和颠换数（V）的比值为1.1，颠换数和转换数的平均值分别为41和44.在第1、2、3位点的转换数和颠换数的比值为3.9、10.5、0.8.转换和颠换主要发生在第3位点，转换数为31个，频率总数为72.0%；颠换数为37个，频率总数为92.5%.通过DAMBE 6.4.67软件进行序列饱和度分析，饱和度分析散点图（图1）表明，遗传距离与碱基替换频率呈线性增加的关系，没有出现饱和态趋势，可以建立系统发育树.

图1 基于CO I基因序列碱基替换饱和度

2.3 遗传距离分析

在MEGA 7.0软件中，基于K2P（Kimura-2-Parameter）模型计算16种腺水螨的种内、种间遗传距离，结果显示（见表3），种内遗传距离变动范围0～0.07，其中种内遗传距离大于2%的有2种，分别为L.porosa0.07和L.schechteli0.023，其余种内遗传距离均小于2%.种间遗传距离变动范围为0.025～0.218.除L.porosa和L.schechteli外，其余物种的种间平均遗传距离为0.147，种内平均遗传距离为0.003，种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的49倍.

表3 基于COⅠ基因序列16种腺水螨的种内和种间的遗传距离

2.4 ABGD的评估结果

93条序列ABGD的评估结果显示，ABGD法可以明显出现条形码间隙（图2a）.物种划分结果见图2b，包括初始划分和递归划分，初始划分较为稳定，遗传距离在0.001～0.100之间，被划分为13个物种，少于形态学分类结果，而递归划分结果显示，遗传距离在0.001、0.001 274、0.001 624时支持27个物种；在0.002 069、0.002 637时，支持24个物种；在0.003 360、0.004 281、0.005 456时，支持23个物种；在0.006 952时，支持22个物种；在0.008 859时，支持21个物种；在0.011 288时，支持20个物种；在0.014 384、0.018 330、0.023 357时，支持19个物种；在0.029 764、0.037 927时，支持16个物种；在0.048 329、0.061 585时，支持15个物种；在0.078 476、0.100 000时，支持13个物种.P值在0.014 384、0.018 330、0.023 357时，和邻接法系统发育树所评估的物种数量相同.

图2 基于ABGD腺水螨属部分物种分析结果

2.5 系统发育树的构建

在MEGA 7.0软件中以Sperchonopsis ecphyma和Sperchon rostratus作为外群［9］，以NJ法构建系统发育树，结果显示（见图3），除L.porosa聚集为3支外，其余不同的物种均能聚为单系，例如L.schechteli的12条序列、L.maculosa的7条序列、L.salebrosa的4条序列、L.reticulata的3条序列等均以100%的高支持率聚集为一支.

ABGD所划分的物种与NJ所构建的系统发育树稍有区别（图3）.ABGD除将L.porosa划分为3个组外，还将L.schechteli划分为2个组，其余划分与形态结果一致.

图3 NJ系统发育树和ABGD划分结果

3 讨论

水螨亚股Hydrachnidiae是蜱螨亚纲中一类体型微小，形态构造复杂的类群.近年来，随着分类人员队伍的萎缩，水螨的形态鉴定面临着更大的困难.DNA条形码技术的出现，为解决这一困难提供可能.目前，水螨类群中的Brachypodopsis、Krendowskia、Koenikea、Hygrobates、Sperchon等已经开始使用DNA条形码进行辅助鉴定，并取得较好的效果［10-13］.然而，腺水螨属的DNA条形码研究未曾开展.本研究利用Genbank中下载的腺水螨93条COI基因序列进行DNA条形码的分析，探讨其在腺水螨类群中适用性.

Hebert对DNA条形码研究后曾提出，动物种内遗传差异2%的阈值和种间差异为种内差异10×的标准［3，14］.本研究的16种腺水螨中，L.porosa和L.schechteli的种内遗传距离大于2%，其余物种的种内遗传距离均小于2%，仅L.porosa和L.schechteli不符合Hebert提出2%的阈值.除L.porosa和L.schechteli外，种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的49倍，符合10×的标准.

为继续验证COI基因是否可以应用于腺水螨属的DNA条形码序列，本研究应用ABGD软件进行物种划分并构建系统发育树.ABGD对物种的划分结果显示，可以形成明显的条形码间隙，并将L.porosa划分为3个组，L.schechteli划分为2个组.系统发育树的结果显示，除L.porosa分为3个分支外，其余的物种均能以100%的高支持率聚为单独的一支.系统发育树的划分结果和ABGD对物种的划分结果基本相同.

由遗传距离、系统发育树和ABGD的分析结果来看，本研究所使用的16种腺水螨，除L.porosa和L.schechteli，其余腺水螨均能够使用COI基因片段作为DNA条形码进行区分.Pešić等［10-11］通过分子序列的研究已经证实，在Hygrobates和Brachypodopsis等水螨物种中可能存在隐存种，本研究中的L.porosa和L.schechteli遗传距离大于2%，在系统发育树中分为不同的分支，ABGD划分为不同的物种，这些均显示L.porosa和L.schechteli中可能存在隐存种.如果要进一步确定隐存种，还需要更多的形态研究和分子数据分析.

DNA条形码技术发展至今已经成为形态学鉴定的有效补充，本研究的结果也证明DNA条形码可以用于腺水螨属的物种鉴定.但本研究所涉及的物种数有限，是否能够适用于所有的腺水螨，还需要后续深入的研究.同时，也要注意在进行DNA条形码分析时不能完全脱离形态分类研究，两者相辅相成，才能促进分类学的发展［15］.