敲减miR-145增强骨髓间充质干细胞对大鼠盆底功能障碍的修复作用

张小燕，陈 慧，陈 婧，耿月华

(中国人民解放军联勤保障部队第九〇九医院a.妇产科； b.病理科，福建 漳州 363000)

盆底功能障碍性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)是一种严重影响女性生活质量的常见病及多发病，尤其常见于中老年女性，主要表现为压力性尿失禁(stress urinary inconti-nence，SUI)和盆底器官脱垂(pelvic organ prolapse，POP)，给患者带来巨大的精神压力和经济负担，已引起盆底医学研究者的广泛关注。随着社会进入老龄化时期，PFD患者越来越多，SUI及POP分别影响着15%～17%和3%～ 6%的成年女性[1]。PFD的发生与盆底支持组织结构的破坏或缺陷有关[2-3]。盆底支持组织主要是含有细胞外基质(ECM)的成纤维细胞产生的胶原蛋白及弹性蛋白等纤维蛋白，而这些蛋白的缺乏可能导致PFD[4-5]。目前临床上对于症状严重的PFD患者主要以手术恢复其解剖学位置为主，但术后并发症多，复发率高[6]。因此，有必要开发一种新的盆底支持结构用于PFD的治疗，实现其在分子水平及组织生理功能上的重建，并维持盆底支持结构的微环境平衡。

干细胞具有多向分化的能力，能够参与组织修复，有可能分化为多种细胞类型的支持组织，因此在PFD治疗中具有广阔的应用前景。骨髓间充质干细胞(bone mesenchyma stem cell，BMSC)是最具特征性的干细胞来源之一，具有很强的分化能力，并分泌有利于组织修复的生物活性因子；同时BMSC也是最早应用于盆底功能修复的间充质干细胞类型[7]。在SUI动物模型中，注射BMSC能修复受损的外尿道括约肌，并显著减轻SUI症状[8-9]。此外，miRNA在BMSC分化过程中发挥着不可或缺的作用。有研究[10]表明敲减miR-145表达可增强皮肤成纤维细胞重编程及诱导其分化为多能干细胞的能力。基于BMSC的细胞治疗，也是盆底医学领域的研究热点，BMSC是一种很有临床应用前景的治疗策略，有可能成为彻底改变POP和SUI的治疗方法[11-13]。因此，本研究旨在观察干预BMSC中miR-145的表达是否能协同增强BMSC对PFD的骨盆支持组织缺损的修复作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

35只SPF级6月龄雌性SD大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004；本研究的所有动物获得中国人民解放军联勤保障部队第九〇九医院动物伦理委员会批准，且所有实验步骤均符合动物实验“3R”指南。

1.1.2 主要试剂与仪器

IMDM培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(美国Gibco公司)；1%链霉素/青霉素双抗溶液(美国Sigma-Aldrich公司)；曲拉通(Triton X-100)试剂和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(北京索莱宝科技有限公司)；大鼠BMSC的标记抗体Alexa Fluor 647-CD29、FITC-CD44、FITC-CD45、PE-CD73和APC-CD90抗体(美国BD公司)；Ⅰ型胶原(Collagen Ⅰ)(英国Abcam公司)；弹性蛋白(Elastin)(美国Santa Cruz公司)；SlowFade Gold抗淬灭荧光封片剂(美国Life Technologies公司)；miR-145-shRNA慢病毒载体和miR-NC慢病毒对照载体由汉恒生物科技(上海)有限公司合成；RNeasy Plus Mini试剂盒和QuantiTect逆转录试剂盒(美国Qiagen公司)；RIPA裂解液、DAPI染色剂、BCA蛋白测定试剂盒和β-actin抗体(上海碧云天生物科技有限公司)；CCK-8细胞活力检测试剂盒、ECL发光底物试剂盒和HRP标记的二抗(万类生物科技(上海)有限公司)。IX81显微镜(日本Olympus公司)；CytoFLEX S流式细胞仪(德国Beckman公司)；压力传感器(美国Grass Instruments公司)；ELX800酶标仪购自美国BioTek公司；注射泵(美国KD Scientifi公司)；电泳电转系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代BMSC的分离和培养

从3只6个月龄雌性SD大鼠股骨骨髓中分离BMSC，培养于含有20% FBS和1%链霉素/青霉素的IMDM培养基中，每3 d换液1次。待细胞融合至80%时，用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，并重新以5×105个·mL-1密度接种到培养瓶中，标记为第1代，按照此方法传代，取纯化的第3代BMSC用于鉴定。

1.2.2 免疫荧光法和流式细胞术鉴定BMSC

免疫荧光法：第3代BMSC以每孔2500个细胞的密度种于24孔室玻片上，细胞贴壁后，用4%多聚甲醛固定过夜，PBS冲洗，用10% BSA封闭45 min，再用0.1% Triton X-100透过5 min，4 ℃下分别孵育Alexa Fluor 647-CD29(1:200)和FITC-CD44(1:100)抗体过夜，PBS冲洗，DAPI染核5 min，用SlowFade Gold防淬灭剂封片，并用荧光显微镜观察。流式细胞术：将第3代BMSC制成1×105个·mL-1密度的细胞悬液，用10% BSA封闭30 min，然后分别避光孵育1:200稀释比例的表面抗体FITC-CD44、FITC-CD45、PE-CD73和APC-CD90抗体，并设立同种型对照，流式细胞仪检测。

1.2.3 miR-145-shRNA慢病毒转染BMSC

取第3代BMSC以每孔1×105个接种到24孔板中，次日用2 mL含6 μg·mL-1聚酰胺的新鲜IMDM培养基替换原培养基，分别加入20 病毒感染复数(multiple of infection,MOI)miR-145-shRNA慢病毒载体或对照miR-NC慢病毒载体培养24 h，然后更换新培养基继续培养48 h。收集细胞，用RNeasy Plus Mini试剂盒提取细胞的总RNA，然后逆转为cDNA，并用RT-qPCR法检测转染miR-NC或miR-145-shRNA的BMSC中miR-145的表达水平，用来评估转染效率。

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力

分别取转染miR-NC或miR-145-shRNA的BMSC以每孔1×104个接种到96孔板中，分别培养0、3、5和7 d。加入CCK-8试剂在37 ℃条件下孵育2 h，用酶标仪测量450 nm波长处吸光度值。

1.2.5 大鼠PFD模型的建立

将剩余32只大鼠按照随机对照表法分为4组：对照组(Con)、PFD模型组(PFD)、miR-NC治疗组(miR-NC)和miR-145-shRNA治疗组(miR-145-shRNA)，每组8只。按照文献[14]方法，用阴道扩张方式构建PFD模型：将18F导管插入大鼠阴道，并用3-0丝线固定，然后向连接压力传感器的Foley球囊进行注水3.0 mL，并维持对盆底支持组织产生持续0.15 kg压力状态4 h，放水并与压力传感器一并取出。Con组只插导管不注水。miR-NC组和miR-145-shRNA组大鼠在取出压力传感器后，分别通过尾静脉注射1×106个已转染miR-NC和miR-145-shRNA慢病毒载体的BMSC。于阴道扩张14 d后，分别测定膀胱内压和漏尿点压。

1.2.6 膀胱内压测定

腹腔注射1.2 g·kg-1乌拉坦麻醉各组大鼠，然后将PE-50膀胱导管插入大鼠膀胱，导管经三通装置连接到一个微量注射泵和一个压力传感器。用手排空膀胱，记录膀胱基线压力值；然后通过导管以5 mL·h-1的速度向每个膀胱输注37 ℃的生理盐水，充满膀胱直到出现自发性排尿现象，在此过程中记录膀胱自发性收缩压力值、最高收缩压力值和自发性收缩时的排尿容积。每只大鼠重复进行3次试验。排尿时膀胱内压=最高收缩压力平均值-膀胱基线压力平均值。

1.2.7 漏尿点压测定

腹腔注射1.2 g·kg-1乌拉坦麻醉各组大鼠，然后将PE-50膀胱导管插入大鼠膀胱，导管经三通装置连接到一个微量注射泵和一个压力传感器。用手排空膀胱，并记录此时的膀胱基线压力值；然后通过导管以5 mL·h-1的速度向每个膀胱输注37 ℃的生理盐水，当达到0.4 mL(约膀胱容量的一半)时，用手缓慢按压大鼠下腹部以增加膀胱内压力，直到漏尿现象，迅速松开手，记录无张力收缩时漏尿的峰压力值。每只大鼠重复进行3次试验。漏尿点压=无张力收缩时漏尿的峰压力平均值-膀胱基线压力平均值。

1.2.8 western blot法检测目的蛋白表达

麻醉大鼠后，断头处死，解剖并收集大鼠盆底支持组织。用RIPA提取组织样品中总蛋白。用BCA蛋白测定试剂盒对样品的总蛋白定量后，将各样品等量蛋白变性后，经SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂乳封闭膜后，4 ℃下分别孵育Collagen Ⅰ(1:1000)、Elastin(1:2000)和β-actin(1:8000)过夜，用TBST洗膜后，室温孵育HRP标记的二抗1 h，再次洗膜后，用ECL发光底物试剂盒使得条带显像。用Image J测量蛋白的相对表达量。

1.2.9 统计学方法

使用SPSS 19.0软件进行数据处理。计量资料以均值±标准差表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSC的鉴定

免疫荧光法显示，第3代BMSC中，BMSC的特异表面标志物CD29和CD44的表达均呈阳性(图1A)。流式细胞术分析显示，第3代BMSC中间充质干细胞特异性标志物CD44、CD73和CD90的表达均呈阳性，而造血干细胞特异性标志物CD45的表达呈阴性(图1B)。表明成功分离获得BMSC。

A：BMSC细胞中CD29和CD44的表达(免疫荧光染色，×400)；B：BMSC细胞表面CD73、CD44、CD90和CD45的表达(流式细胞术)。

2.2 BMSC中miR-145的表达及其活力

RT-qPCR结果显示，与miR-NC组比较，miR-145-shRNA组BMSC中miR-145的表达降低(P<0.001)。见图2。CCK-8结果显示，与miR-NC组比较，miR-145-shRNA组BMSC的细胞活力明显增加(P<0.01或P<0.001)。见图3。

*P<0.001与miR-NC组比较；n=4。

2.3 各组大鼠的尿流动力学比较

与Con组相比，PFD组大鼠的膀胱容积(图4A)、排尿时膀胱内压(图4B)以及漏尿点压(图4C)均显著降低(P<0.01或P<0.001)，表明大鼠PFD造模成功。与PFD组比较，注射转染miR-NC的BMSC可在一定程度上增高PFD大鼠的膀胱容积(图4A)、排尿时膀胱内压(图4B)以及漏尿点压(图4C)(P<0.05或P<0.01)。与miR-NC组比较，miR-145-shRNA组大鼠的膀胱容积(图4A)、排尿时膀胱内压(图4B)以及漏尿点压(图4C)均升高(P<0.05或P<0.01)。

A：膀胱容积；B：膀胱内压；C：漏尿点压。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=8。

2.4 各组大鼠盆底支持组织中Elastin和Collagen Ⅰ的蛋白表达比较

western blot结果显示，与Con组比较，PFD组大鼠盆底支持组织中Elastin和Collagen Ⅰ表达水平显著降低(均P<0.001)；与PFD组大鼠比较，miR-NC组和miR-145-shRNA组大鼠盆底支持组织中Elastin和Collagen Ⅰ表达水平均显著增加(P<0.05或P<0.001)，其中miR-145-shRNA组大鼠盆底支持组织中Elastin和Collagen Ⅰ表达水平明显高于miR-NC组(P<0.05)。见图5。

A：Collagen Ⅰ和Elastin蛋白印迹图；B：Collagen Ⅰ的相对表达；C：Elastin的相对表达。*P<0.05，**P<0.001；n=8。

3 讨论

目前，盆底支持组织缺陷被认为是导致PFD病理生理学发展的重要原因之一[2-5]。Elastin是多种支持组织(如韧带和主动脉)ECM中弹性纤维的主要成分，其能在没有能量的情况下促进组织的伸展和恢复到原来的状态[15]。胶原蛋白是ECM中另外一种重要的结构蛋白，其在维持盆底支持组织的弹性和韧性中起重要作用[16]。弹性蛋白纤维降解及胶原蛋白流失可导致韧带、筋膜等盆底支持组织的张力降低和支持组织结构的松弛，并最终导致PFD的发生[4-5]。因此，恢复PFD盆底支持组织中Elastin和胶原蛋白的含量可增加盆底支持组织的弹性和韧性，可在一定程度上逆转PFD的症状。

BMSC因具有很强的分化能力和分泌有利于组织修复的生物活性因子的能力，其在软组织修复和重建中的潜力已被广泛报道[17-18]。如，BMSC移植能促进新生组织的生长以及体内伤口愈合动物模型中沉积的胶原[18]。在与PFD相关的治疗研究中，CORCOS等[7]发现，注射BMSC能修复受损的外尿道括约肌，显著改善SUI症状；JIN等[8]研究显示，注射BMSC能恢复PFD盆底支持组织中Elastin和胶原蛋白的含量，缓解PFD的SUI症状。本研究也同样显示，与PFD模型组比较，注射BMSC能增加PFD盆底支持组织中Elastin和胶原蛋白的含量，并一定程度上恢复因阴道扩张而受损盆底组织的功能(增加膀胱容积、排尿时膀胱内压和漏尿点压)。近来研究[16,19-20]显示，改变BMSC中某些miRNAs的表达可增强BMSC对受损组织的恢复功能，如上调BMSC中miR-29表达能增强BMSC对PFD受损盆底支持组织弹性和韧性的恢复[16]；miR-145修饰的BMSC可通过TGF-β/Smad调节大鼠阴茎中平滑肌细胞和Collagen Ⅰ含量，改善其勃起功能[19]。另外，已有报道[20]显示，过表达miR-145能增加血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠腹主动脉中Elastin和胶原蛋白降解的发生率，反之，敲减miR-145能降低血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠腹主动脉中Elastin和胶原蛋白降解的发生率。本研究结果显示，在PFD大鼠模型中，与注射miR-NC慢病毒载体转染的BMSC比较，注射miR-145-shRNA慢病毒载体转染的BMSC的大鼠Elastin和Collagen Ⅰ表达水平均明显增加，且膀胱容积、排尿时膀胱内压和漏尿点压均明显增高，说明敲减BMSC中miR-145表达能增强BMSC对PFD的修复作用。虽然如此，本研究依然具有很多局限性需要考虑：比如，注射miR-145-shRNA-BMSC是通过何种信号途径上调PFD大鼠盆底支持组织中Elastin和Collagen Ⅰ表达，以及注射miR-145-shRNA-BMSC是否能调节其他修复相关蛋白参与增强BMSC对PFD的修复作用；另外，改变BMSC中其他miRNAs的表达是否也能影响BMSC对PFD的修复作用等一些未知的问题。这些未知的问题仍有待更多的研究去证明。

总之，本研究结果提示抑制BMSC中miR-145的表达可提高BMSC移植对PFD大鼠的治疗潜力。同时，本研究综合了miRNA生物学和基因工程BMSC技术，为寻找PFD的潜在疗法提供了一个新方向。