益生芽孢杆菌对鱼类生长与抗病力影响的研究进展

张宇柔，陈玉珂，于梦楠，雷新雨，王嘉婧，高永生，王秋举，MAHMOUD M. Elsadek，张东鸣,3

( 1.吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118； 2.吉林农业大学 动物科学技术学院/动物医学院，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，吉林 长春 130118；3.通化师范学院，吉林 通化 134000 )

随着我国水产养殖业的快速发展，我国水产养殖的产量已达到世界总产量的3/4[1]。而随着鱼类产量的提高，鱼类疾病成为水产养殖业的一个严峻的问题[2]。过去很长一段时间，抗生素等药物一直是预防鱼类疾病的有效选择，但抗生素的大量使用也导致了药物残留和耐药性细菌的出现[3]，同时也损害鱼类的免疫系统，并对鱼类的消化道菌群产生不利影响[4-6]。鱼类的肠道环境是机体抵抗疾病发生的重要生理屏障，吞噬细胞对抗原摄取和处理主要发生在鱼类肠道的黏膜表面，黏膜屏障与病原微生物之间的动态相互作用可以诱发炎症反应以及改变肠道的屏障功能[7]。研究发现，益生菌可通过调节鱼类肠道黏膜屏障功能防止病原菌定殖，其在鱼类黏膜免疫中发挥重要作用[8]。因此，近年来益生菌作为抗生素的安全替代品之一，以饲料添加剂形式广泛应用于水产养殖中[9]。与乳酸杆菌(Lactobacillus)等相比，芽孢杆菌(Bacillus)可形成保护其免受环境影响的内生孢子，在鱼类疾病的预防上更加具有优势。益生芽孢杆菌可作为饲料添加剂促进生长、促进消化、抑制病原菌和增强鱼类免疫，同时调节鱼类肠道微生物区系，对鱼类的健康养殖具有重要意义。笔者概述了益生芽孢杆菌的种类、特征及作用机理，综述了其在鱼类养殖过程中对鱼类的生长性能、免疫功能以及抗病力的影响，为鱼类的疾病防控和健康养殖提供理论依据。

1 益生芽孢杆菌的概述

1.1 益生芽孢杆菌的种类和特征

芽孢杆菌属为革兰氏阳性，过氧化氢酶阳性，杆状(2.5～10.0 μm)，无荚膜，是需氧或兼性厌氧菌，具有丰富的鞭毛用于运动[10]。在非选择性培养基上，芽孢杆菌通常呈现大而扁平的菌落形态[11]。芽孢杆菌与其他益生菌的显著区别在于在其培养的最后阶段会在细胞内形成厚壁芽孢，也称内生孢子，具有耐高温、高pH、高盐、干燥和抗氧化等特点，可保护芽孢杆菌免受不良环境的影响[12-14]，从而保持良好的生物活性，可在鱼类的消化道中持续生存。同时，芽孢杆菌具有可产生纤维素酶、植酸酶、单宁酶、几丁质酶、木聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶的能力[15-20]。大部分用于水产养殖的益生芽孢杆菌是从鱼类自身肠道、池塘底泥、土壤、堆肥或水环境中分离出来的，研究表明，芽孢杆菌是鱼类本身细菌群落的一部分[21-22]。由于益生菌菌株与病原菌在鱼体内共享相同的生态位[23]，因此在水产养殖中可能更倾向于使用鱼源细菌，以避免对宿主自身的微生物区系产生不良影响。而且这些鱼类内源性芽孢杆菌由于能适应相同的环境从而免受竞争性排斥作用，更具潜力[24-26]。

目前常用于水产养殖的益生芽孢杆菌有地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、蜡状芽孢杆菌(B.cereus)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、坚强芽孢杆菌(B.firmus)等40种以上[27]。其中，地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌经过严苛试验及安全评估被许可收录进2013年我国农业部发布的微生物饲料添加剂品种目录中。

1.2 益生芽孢杆菌在鱼体内的作用机理

鱼类胃、肠道及肠道微生物区系的有效功能对其自身健康起着至关重要的作用[28-30]。如果没有肠道菌群的保护，鱼类正常的免疫功能受损，降低抵抗致病菌感染的能力，同时损害肠道健康，致使肠道菌群失调，增加宿主感染的风险[31-36]。在鱼类肠道中，鱼类的消化功能直接影响鱼类的肠道健康，而肠道黏膜和共生微生物区系则是影响鱼类消化功能的重要因素。其中，肠道微生物区系又分为肠道内微生物和黏附在黏膜表面的微生物，它们对宿主病原菌置换、抗菌因子的产生等具有促进作用[37-38]。

益生芽孢杆菌可通过调节微生态平衡来促进宿主生长和预防疾病，是水产养殖的热门饲料添加剂之一。目前，有关其在鱼体内的作用机理主要有以下3种：(1)益生芽孢杆菌进入鱼类的肠道后，在肠道内大量繁殖迅速形成优势菌群，同时消耗肠道内的氧气创造了一种有利于厌氧益生菌生长的环境，抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)、气单胞菌(Aeromonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)等有害菌群的生长，创造有益微生态环境[39]。(2)益生芽孢杆菌黏附在肠道或其他组织上，与黏膜上皮紧密结合并形成致密菌膜，与病原微生物竞争黏附位点，抑制病原微生物在肠道黏膜上的黏附，阻止其定殖。黏附过程可以通过物理化学因素等非特异性方式实现，也可以通过细菌表面的黏附素分子与上皮细胞上的受体分子结合等特异性方式实现[40-41]。(3)益生芽孢杆菌自身可以直接抑制病原微生物的生长和代谢毒物的产生，分解肠道内残饵和代谢废物，促进宿主肠道蠕动，维持肠道黏膜屏障完整，使肠道微生态系统中的能量流、物质流和基因流可以正常运转[42]。这3种理论虽然机制有所不同，但功效一致，均为抑制病原菌，调节宿主微生态平衡，利于宿主生长。

2 益生芽孢杆菌在鱼类养殖中的研究进展

2.1 益生芽孢杆菌对鱼类生长性能的影响

随着水产养殖的集约化程度越来越高，提高鱼类的生长性能和水产品品质一直是水产研究的热点和目的。益生芽孢杆菌作为饲料添加剂能够促进鱼类生长主要有两方面的原因：一方面，是通过为鱼类提供营养同时影响消化酶活性从而提高消化率或饲料利用率来促进鱼类生长[43]。淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶是益生芽孢杆菌在宿主体内调节的主要消化酶，它们能够消化肠道内的脂类、蛋白质和碳水化合物。鱼类消化酶活性直接反映了宿主对饲料的消化吸收能力，间接反映了鱼类的生长性能。而益生芽孢杆菌对鱼类消化酶活性具有促进作用，其原因可能是益生芽孢杆菌能分泌外源酶，对宿主的内源性酶进行一定的补充，亦或是益生芽孢杆菌能够促进鱼类内源酶的产生[44]。另一方面，益生芽孢杆菌通过产生维生素、有机酸等增加鱼类食欲，降解肠道中难以消化的成分，改善肠道形态，促进营养物质吸收来促进鱼类生长[45]。Adeoye等[46]以尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)为研究对象，对其投喂添加外源酶和3种益生芽孢杆菌的饲料，发现添加外源酶和益生芽孢杆菌组合可使罗非鱼肠道的杯状细胞丰度、微绒毛直径和肠上皮细胞总吸收面积均高于对照组，改善罗非鱼的生长性能。Kuebutornye等[47]也在尼罗罗非鱼上证实了相似的结果。益生芽孢杆菌对草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鳗鲡(Anguillajaponica)、金头鲷(Sparusaurata)的肠道形态参数也有积极影响[48-50]。

益生芽孢杆菌对鱼类产生影响的一个必要前提是在鱼肠道内定殖，因此其黏附性是益生芽孢杆菌筛选的标准之一。Zhao等[51]将从草鱼肠道分离的副地衣芽孢杆菌(B.paralicheniformis)添加到饲料中后饲喂草鱼2周，在停止饲喂后的220 d内使用免疫荧光法标记副地衣芽孢杆菌在草鱼肠道内的动态，结果发现，其荧光信号在第40天到第60天间趋于平稳，第80天依然在草鱼肠道中保持可见，在第220天仍能从肠道内容物中重新分离到副地衣芽孢杆菌。说明副地衣芽孢杆菌可在草鱼肠道内黏附并定殖。现有的研究成果(表1)表明，饲喂效果好的益生芽孢杆菌大部分分离自鱼类自身肠道，其原因可能是这些鱼类内源性芽孢杆菌能适应相同的环境从而免受竞争性排斥作用，且这些内源性芽孢杆菌在宿主肠道的黏附作用具有特异性，因此在鱼类饲料应用方面更具有潜力。

表1 饲料中添加益生芽孢杆菌对鱼类的生长性能、消化酶活性和肠道菌群的影响Tab.1 Effects of dietary probiotic Bacillus on growth performance, digestive enzyme activities and intestinal microflora in fish

益生芽孢杆菌对多种鱼类的生长具有促进作用，并在鱼类肠道中定殖且形成优势菌群。不同鱼类对益生芽孢杆菌的最适需求量也不同。然而也有部分证据表明，饲料中添加益生芽孢杆菌对达氏鲟和大菱鲆的生长性能和消化酶活性无显著影响[64]。原因可能是益生芽孢杆菌的添加量和饲喂方法不同，也可能是养殖条件不同，如水的理化参数、放养密度、摄食率以及鱼的规格等因素均会对鱼类的性能产生影响。目前益生芽孢杆菌添加量与鱼体规格间还没有具体的规定，但总体来说，大规格鱼需要添加较多剂量的益生芽孢杆菌，小规格鱼需要益生芽孢杆菌的剂量较少。当益生芽孢杆菌作用于鱼类时，益生芽孢杆菌单独或组合使用，多会提高宿主的生长性能和饲料利用率，且不同益生芽孢杆菌对同种鱼类的作用效果不同，同种益生芽孢杆菌的剂量不同对宿主的作用效果也不同。

2.2 益生芽孢杆菌对鱼类免疫和抗氧化功能的影响

益生芽孢杆菌已成为抗生素的安全替代品，可作为饲料添加剂增强鱼类免疫力而减少疾病的产生。在抑制疾病方面，鱼类的非特异性免疫比特异性免疫更为重要[67]，其中体液免疫因子作为鱼类非特异性免疫应答的效应分子，对病原微生物具有直接的防御作用。益生芽孢杆菌可通过调节鱼类的体液免疫因子和免疫基因的表达来调节鱼类的非特异性免疫[44]。研究发现，酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、溶菌酶、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶等血清免疫因子对病原微生物具有杀灭作用[12,48,68-69]。目前报道较多的还有补体C3、干扰素、免疫球蛋白、白细胞介素、肿瘤坏死因子α以及其他头肾免疫相关基因mRNA的表达。以上免疫指标活性的增加均能证明鱼类免疫应答的增强[70-73]。有研究表明，贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)单独或共同作为添加剂均可通过调节血清免疫和黏膜免疫增强尼罗罗非鱼的免疫应答[73]；地衣芽孢杆菌对草鱼也具有同样的效果[48]。Li等[74]研究表明，贝莱斯芽孢杆菌可通过调节杂交石斑鱼(E.lanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、补体C3的活性及同时调节白细胞介素8、免疫球蛋白、CC趋化因子、Toll样受体(TLR-3、TLR-5)等相关免疫基因来增强其免疫功能。另外，益生芽孢杆菌也对鱼类肠道黏膜免疫活性起作用[75-76]。鱼类的肠黏膜上皮为单柱状细胞，包括肠上皮细胞、杯状细胞和散在的纤毛细胞。其中杯状细胞能分泌具有杀菌作用的黏液，在肠道内形成保护性黏液层，可防止病原体进入肠道，同时维持肠上皮的完整性。Elsabagh等[68]研究发现，投喂益生芽孢杆菌的尼罗罗非鱼肠道内PAS阳性杯状细胞数量与对照组相比明显增多，证实随着肠道黏膜免疫活性的增强，黏液分泌的增加与鱼类服用益生芽孢杆菌有关。

益生芽孢杆菌对鱼类的抗氧化能力也有一定影响。当鱼类因生存的水环境发生变化而受到刺激时，组织或细胞内的自由基增加会导致氧化剂如活性氧的产生，当氧化剂的蓄积超过组织或细胞的抗氧化能力时，鱼类就会出现氧化应激反应。这种损伤可通过抗氧化酶活性的增强来抵消。Hindu等[77]研究发现，益生芽孢杆菌在鱼体内产生的超氧化物歧化酶可有效的消除自由基来调节鱼类的抗氧化能力；Qin等[48]也发现，地衣芽孢杆菌可通过提高草鱼血清中超氧化物歧化酶活性和降低丙二醛水平来增加其抗氧化能力。

2.3 益生芽孢杆菌对鱼类抗病力的影响

细菌感染是鱼类养殖过程致病的主要原因，气单胞菌、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、邻单胞菌(Plesiomonas)、爱德华氏菌(Edwardsiella)等均会造成鱼类的细菌性疾病。多项证据表明，益生芽孢杆菌添加在水产饲料中可抑制鱼类细菌性疾病的发生[78-81]。益生芽孢杆菌的抑菌活性表现在其产生的活性物质可对多种鱼类病原微生物产生抗菌作用。一方面，益生芽孢杆菌通过对病原菌直接的拮抗作用提高宿主的抗病力。拮抗作用在维持鱼类潜在益生菌与病原菌的平衡上不可或缺[82]，益生菌对病原菌的生长抑制作用可能是通过单独或与其他益生菌或益生元联合作用产生细菌素、溶菌酶、蛋白酶、铁载体等抗菌代谢物，或通过产生的有机酸改变肠道内的pH，或与病原菌竞争必需营养素等方式实现的[40]。另一方面，益生芽孢杆菌可调节鱼类肠道微生物菌群的平衡，使肠道内优势菌群及细菌呈上升趋势，与病原菌争夺营养空间，使有益菌数量增加，有害菌数量减少，增强鱼类免疫系统功能，从而抑制病原微生物对鱼类的致病性[83]。也有研究者发现[44]，益生芽孢杆菌可通过降低谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性防止鱼类肝组织损伤，而益生芽孢杆菌用于防止鱼类免受病毒性疾病的研究在鱼类养殖上鲜有报道。由表2可知，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌等可与多种鱼类病原菌产生拮抗作用并增强鱼类抗感染能力，但也有研究表明，在饲料中添加20 g/kg的芽孢杆菌对金头鲷病原菌的血清杀菌效果不显著。其原因可能是益生芽孢杆菌剂量或饲喂时间未达到对病原菌致死的效果，但金头鲷血清中免疫球蛋白M水平显著提高，这说明益生芽孢杆菌对其免疫功能具有促进作用[78]。有研究表明，在从鲤肠道中分离出的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中，只有解淀粉芽孢杆菌对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)和不动杆菌(Acinetobacter)这两种鱼类病原菌显示出抑菌活性[84]。多项研究(表2)表明，添加不同剂量的益生芽孢杆菌对鱼类病原菌的抑制效果不同，在处于安全剂量的前提下，通常，细菌剂量高时抑制病原菌和增强鱼类免疫力效果更加显著。

表2 饲料中添加益生芽孢杆菌对鱼类抗细菌性疾病能力的作用效果Tab.2 Effect of dietary probiotic Bacillus on anti-bacterial diseases in fish

3 结语与展望

益生芽孢杆菌，因其具有可抵抗不良环境影响而稳定存在的优势，在鱼类养殖上应用前景良好，且由于它对鱼类无毒害和无不良副作用，还可对鱼类机体内外微生态环境同时进行调节[91]，已成为国内外抗生素替代研究的重点与热点。多项研究证明，益生芽孢杆菌作为绿色微生态制剂在鱼类养殖上具有显著的功效，但在其生产和应用中仍然存在不足：(1)目前投入生产的鱼源菌种依然较少；(2)益生芽孢杆菌在培养和传代过程中益生功效逐渐降低；(3)益生芽孢杆菌作为水产饲料添加剂其益生功能未得到充分挖掘；(4)益生芽孢杆菌制剂在制作和使用过程中容易失活等。同样，关于益生芽孢杆菌作用机制的研究中有些问题也未得到解答：(1)益生芽孢杆菌在鱼体内的具体黏附机制是什么？(2)益生芽孢杆菌在鱼体内抑制病原菌的具体作用方式是什么？(3)益生芽孢杆菌对鱼类的病毒感染是否同样具有抑制作用？针对以上问题，建议今后加强以下方面的研究：(1)继续筛选和验证鱼源益生芽孢杆菌，扩大鱼源益生芽孢杆菌在实际生产上的种类；(2)可利用基因组学[92]技术获得益生效果更好、稳定性更高的鱼源益生芽孢杆菌，使其益生效果在水产饲料应用中充分发挥；(3)继续探究益生芽孢杆菌添加到饲料中的方式，如微胶囊包埋技术、冻干添加以及热灭活添加等，也可通过改良制作工艺如冷制粒机的应用，以确保益生芽孢杆菌在添加和使用过程中的活性；(4)可利用代谢组学等技术探究肠道微生物及其代谢产物与宿主之间的作用机制，也可探究其抑制病原菌的免疫方式，代谢组学目前在家畜上应用较为广泛[93]，但其在鱼类养殖上的应用还需进一步开发。这些问题的解决可为益生芽孢杆菌在鱼类养殖上的科学利用提供更加详尽的数据支持和参考。