一株耐盐硅藻杯状藻的生长和生化组成分析

张 琪，郑凌凌，李天丽，刘 津，宋立荣

( 中国科学院 水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，中国科学院藻类生物学重点实验室，湖北 武汉 430072 )

硅藻作为天然水体中的重要初级生产者，是鱼、虾、蟹、贝类等水产品的重要饵料[1]，同时因其富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素(如岩藻黄素)及其他生物活性物质也被广泛应用于食品和保健品等[2]。与蓝藻一样，硅藻也是沿海或内陆高盐水体中的常见初级生产者[3]。淡水和耕地资源匮乏问题日益制约着我国经济发展和生态环境，利用我国丰富的海水资源以及大面积待开发利用的滩涂、盐碱地，是微藻规模化养殖的重要研究和应用方向[4]。大量研究表明，在潮间带、江河入海口及盐田中，盐度是影响藻类生长的主要因素之一，并且影响胞内理化成分的合成和积累[5-7]。野外和室内试验研究均显示，盐度明显影响硅藻生长[8]、硅藻外壳形态[9]、细胞大小[10]、光合作用和初级生产力[11]、氧化胁迫响应[12]以及蛋白、碳水化合物和脂质含量等[13]。在利用滩涂或盐碱地等进行微藻开放式规模化海(盐)水培养时，培养基的补充和蒸发引起培养基盐度的大幅波动，导致微藻生物量下降和培养困难，造成培养成本上升[2]。因此，筛选出一株在较宽盐度范围内生长良好且生化组成相对稳定的耐盐藻株，将有助于降低培养基盐度变化带来的不利影响。

杯状藻属 (Craticula) 是一类壳体对称的双壳缝硅藻，其壳体常呈披针形或椭圆披针形、两端呈喙状或头状，隶属于硅藻纲、舟形藻目、辐节藻科，广泛分布于各种生境，常见于酸性、碱性、(高)盐、(超)富营养化等水体[14]，在碱性、微咸和温暖的水体中有较高的多样性[15]，甚至在南极地区也有发现[16]。前期从国内不同的淡水、咸水和海洋环境中分离了多株硅藻，初步筛选出一株自国内盐湖中分离的盐度适应性广、生长较快、营养丰富、具有作为新资源开发潜力的杯状藻 (Craticulasp.)。通过分析不同NaCl水平对杯状藻细胞生长、光合参数、多糖、可溶性蛋白、总脂以及脂肪酸组成的影响，总结不同NaCl水平下其生理生化变化特性，为该藻株的筛选评价和开发利用提供依据，同时也有助于理解硅藻对盐胁迫的生理响应以及盐度变化的适应特性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料杯状藻由笔者分离纯化，并保存于中国科学院淡水藻种库(FACHB-collection)，藻株编号为FACHB-2450 (图1)。

图1 光镜 (a) 和扫描电镜 (b)下杯状藻藻株FACHB-2450的显微照片Fig.1 Micrographs of Craticula sp. FACHB-2450 by light microscopy (a) and scanning electronic microscopy (b)

1.2 试验方法

1.2.1 微藻培养方法

培养条件：采用f/2培养基将保藏的藻种活化扩大培养[17]，然后将活化后的藻种置于不同质量分数NaCl培养基中驯化适应。以f/2培养基(NaCl质量分数为3%)为基础，设置1.5%、3%、6%、9%和12% 5个NaCl质量分数，对硅藻进行培养并开展相关试验。采用长度为60 cm、直径为3 cm的柱状光生物反应器培养，向300 mL藻液通入空气 (气体流量为0.4 L/min)，在一侧以光照度8000 lx持续照射，温度(25±1) ℃。藻细胞接种于对数增长期，初始生物量为(0.35±0.03) g/L，培养周期为15 d，每个NaCl质量分数组均设置3个平行。

1.2.2 测定指标

生物量测定：接种后每3 d取5～10 mL一定体积的藻液，置于105 ℃烘箱烘至恒质量的GF-CTM纤维滤膜 (Whatman，UK)上用灭菌的超纯水进行洗盐后进行抽滤，随后将滤膜置于105 ℃烘箱中24 h烘干至恒质量，取出滤膜待冷却后称量质量。利用抽滤前后滤膜的干质量差计算出单位体积生物量(B,g/L)。

B=(m1-m0)/V

式中，V为所取藻液体积(L)，m0为空滤膜烘至恒质量的质量(g)，m1为滤过藻液后滤膜烘至恒质量的质量(g)。

冷冻干燥藻粉制备：清洗并收集不同培养条件下的湿藻泥，放入-80 ℃冰箱中冷冻至结冰，然后用真空冷冻干燥机进行冻干，冻干的藻粉保存于-20 ℃冰箱备用。

叶绿素荧光活性最大光化学转化效率Fv/Fm测定：在培养的第8天取样，采用调制式叶绿素荧光仪 (PAM-WATER-ED，Walz，Germany) 进行叶绿素荧光参数的测定。测量前将待测藻液暗适应15 min，先用检测光照射测量初始荧光F0，再用强饱和脉冲光激发，测量最大荧光产量Fm，Fv/Fm(Fv=Fm-F0)可通过叶绿素荧光仪直接测定。

总脂含量测定及脂肪酸组成分析：参考文献[18]的方法，取冻干藻粉置于内含磁力转子的玻璃离心管中，加入10%二甲亚砜—甲醇溶液2 mL，在恒温磁力水浴锅中先于50 ℃水浴抽提0.5 h，再重复抽提2次并合并上清液。加入4 mLV(乙醚)∶V(正己烷溶液)=1∶1，冰浴并磁力搅拌0.5 h，再重复抽提2次，并合并上清液。上清液中加入纯水6 mL，充分摇匀后，待混合液体分相，将分层后的有机相移至另一玻璃瓶中。上层有机相经氮气浓缩至近干，转移浓缩液至已称量质量的离心管中，氮气浓缩至恒质量。总脂含量(ω,%)计算公式如下：

w=(m4-m3)/m2×100%

式中，m2为所取冻干藻粉质量(g)，m3为离心管空质量(g)，m4为将有机相浓缩液加入离心管后氮气浓缩至恒质量的质量(g)。

参考文献[19-20]的方法，取1 mg提取的总脂样品，加入2 mL 2%硫酸—甲醇溶液85 ℃烘箱中反应2.5 h进行脂肪酸甲酯化，再加入NaCl饱和溶液和正己烷萃取得到上层有机相，氮气吹干后，用正己烷定容至1 mL，待色谱检测。利用Agilent7890A-5975C气质联用仪对样品进行分析，通过标准脂肪酸的峰面积计算得到脂肪酸组成及其含量。

多糖含量测定：参考文献[21-22]的方法并加以改进，称取10 mg冻干藻粉后加入适量锆珠以及0.5 mmol/L H2SO4溶液1 mL于MiniBeadbeater 16振荡破碎机 (Biospec, USA) 中破碎，使用Centrifuge 5810 R离心机 (Eppendorf，USA) 10 000 r/min(离心半径7.0 cm)离心2 min后收集上清液，重复加入1 mL 0.5 mmol/L H2SO4溶液振荡破碎离心收集上清液5次。将藻渣重新与上清液混合在一起置于恒温磁力搅拌器中，100 ℃水浴搅拌4 h，3000 r/min(离心半径11.5 cm)离心5 min，将上清液转移至容量瓶中定容。取上清液1 mL加入2.5 mL浓H2SO4和0.5 mL 6%苯酚，混合均匀，冷却至常温后于490 nm波长下测定吸光度。利用葡萄糖为标准品测量出的数据制作标准曲线，利用标准方程计算出上清液多糖质量浓度，最终得到多糖含量(w1，%)。

w1=ρ×V1/m5×100%

式中，ρ为上清溶液多糖质量浓度(g/L)，V1为定容后的上清液体积(L)，m5为所取冻干藻粉质量(g)。

可溶性蛋白含量测定：可溶性蛋白提取方法参考文献[22-23]的方法，称取10 mg冻干藻粉后加入适量锆珠以及400 μL RIPA裂解液 (碧云天)在振荡破碎机中破碎，10 000 r/min(离心半径7.0 cm)离心2 min后收集上清液。在藻渣中加入少量0.5 mmol/L NaOH溶液润洗、收集藻渣并重新与上清液混合。加入0.5 mmol/L NaOH溶液5 mL至上述收集的溶液中，然后置于80 ℃水浴30 min，3000 r/min(离心半径11.5 cm)离心5 min收集上清液，反复抽提若干次直至完全后定容。使用Pierce®BCA Protein Assay Kit蛋白定量分析试剂盒 (Thermo Scientific，USA) 通过Lowry法测定蛋白提取液，以牛血清白蛋白作为标准物，根据测定的标准曲线计算蛋白含量。

1.3 数据处理

采用Excel 2010软件对数据进行处理和制图，并用SPSS 17.0统计软件进行差异显著性分析。

2 结 果

2.1 不同质量分数NaCl对杯状藻生长的影响

杯状藻在NaCl质量分数为1.5%、3%、6%、9%和12%时的生物量随时间变化的曲线见图2。在整个培养周期中，杯状藻的生物量均呈现逐渐增加的趋势，但生长速率随NaCl质量分数增加而呈现先升后降的趋势，按生物量大小排序依次为6%、3%、1.5%、9%和12%质量分数组。在NaCl质量分数为6%时，藻细胞生长最快，培养结束时生物量和生物量产率分别为1.79 g/L和95.33 mg/(L·d)；在NaCl质量分数为12%时，藻细胞的生长受到明显抑制，培养结束时生物量和生物量产率分别为0.69 g/L和22.78 mg/(L·d)。

图2 不同质量分数NaCl下杯状藻生物量的变化Fig.2 Biomass of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

2.2 不同质量分数NaCl对杯状藻最大光化学转化效率Fv/Fm的影响

对培养第8天处于对数生长期的杯状藻最大光化学转化效率Fv/Fm进行测定。结果表明，随着NaCl质量分数的升高，该藻的最大光化学转化效率Fv/Fm呈现先升后降的趋势(图3)。在NaCl质量分数为3%时，该藻Fv/Fm值最高，达到0.63；而在NaCl质量分数为12%时，Fv/Fm值最低，降至0.40。

图3 不同质量分数NaCl对杯状藻最大光化学转化效率Fv/Fm的影响Fig.3 The effect of different NaCl mass fractions on maximum photochemical efficiency Fv/Fm of Craticula sp. FACHB-2450标有不同小写字母表示差异显著(P< 0.05)，下同.The means with different letters are significantly different (P< 0.05); et sequentia.

2.3 不同质量分数NaCl对杯状藻多糖、可溶性蛋白和油脂含量的影响

经培养15 d后，对不同质量分数NaCl培养条件下的杯状藻多糖、可溶性蛋白和油脂含量进行测定。结果表明，随着NaCl质量分数的升高，该藻的多糖含量呈现先升后降的趋势 (图4)。在NaCl质量分数为6%时，该藻的多糖含量最高，为藻细胞干质量的9.96%；而在NaCl质量分数为12%时，多糖含量降至最低，仅为藻细胞干质量的7.01%。该藻的可溶性蛋白含量在NaCl质量分数为1.5%、3%、6%和9%时差异不显著，分别为藻细胞干质量的23.60%、22.78%、23.65%和23.29%；而在NaCl质量分数为12%时，可溶性蛋白含量显著降低，仅为藻细胞干质量的8.39%(P<0.05) (图5)。随着NaCl质量分数的升高，该藻的油脂含量呈现先升后降的趋势 (图6)。在NaCl质量分数为3%时，该藻的油脂含量最高，达到藻细胞干质量的32.46%；而在NaCl质量分数为12%时，油脂含量降至最低，为藻细胞干质量的22.09%。

图4 不同质量分数NaCl下杯状藻的多糖含量Fig.4 Polysaccharides content of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

图5 不同质量分数NaCl下杯状藻的可溶性蛋白含量Fig. 5 Soluble proteins content of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

图6 不同质量分数NaCl下杯状藻的总脂含量Fig.6 Total lipid content of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

2.4 不同质量分数NaCl对杯状藻脂肪酸组成的影响

经培养15 d后，对不同质量分数NaCl条件下杯状藻脂肪酸组成的分析结果显示(表1)，微藻细胞内主要的脂肪酸为肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、棕榈油酸(C16:1)、油酸(C18:1)和二十碳五烯酸(C20:5)等。棕榈油酸 (C16:1)占总脂肪酸含量的30.17%～43.75%，在低质量分数NaCl组相对占比较高。棕榈酸 (C16:0) 占总脂肪酸含量的22.53%～31.45%，随着NaCl质量分数的增加呈现先升后降的趋势，在NaCl质量分数为6%时占比最高。二十碳五烯酸 (C20:5)占总脂肪酸含量的14.79%～20.92%，随着NaCl质量分数的增加也呈现先升后降的趋势，在NaCl质量分数为9%时占比最高。

表1 不同质量分数NaCl条件下杯状藻的脂肪酸组成(占总脂肪酸的比例) %Tab.1 Fatty acid composition (percent of total fatty acids) of Craticula sp. FACHB-2450 under different NaCl mass fractions

3 讨 论

3.1 不同质量分数NaCl对杯状藻生长的影响

硅藻主要生活在淡水、微咸水、海水乃至高盐水体(>30)中，可以适应较宽盐度范围的生境[24]。但不同的硅藻种类具有各自的盐度需求，特定的硅藻类群偏好特定的盐度环境。盐度变化可以影响微藻的生长、形态和生理生化特性。为了响应盐胁迫，微藻可以通过积累脂类 (如脂肪酸、甘油)、碳水化合物 (如葡萄糖等单糖以及蔗糖、海藻糖等双糖) 和蛋白类 (如谷氨酸和脯氨酸等自由氨基酸)等具有调节渗透压功能的有机化合物，利用反渗透物质调节渗透压，防止细胞质壁分离[25-26]。

本试验中，所用杯状藻盐度适应范围比较广，在NaCl质量分数为1.5%～12%时均能生长 (在NaCl质量分数为6%时生长最快)，但是过高或过低质量分数NaCl均会抑制生长。一些硅藻区系研究表明，许多发现于高盐生境中的硅藻物种也可以生活在海洋或咸水环境中，可以在较宽的盐度条件下生长[27-29]。广盐性是生活在高盐生境中的硅藻对环境盐度变化的一种适应方式[30-31]。已有的研究表明，微藻在盐胁迫条件下耗费了大部分能量用于维持细胞膨压和抵御渗透压，而不是用于支持生长[25,32]。本试验结果同样也支持了盐胁迫会降低微藻生物量产率的观点[33]。最大光化学转化效率Fv/Fm表示光合系统PSⅡ的最大光化学量子产量，即PSⅡ的原初光能转换效率[34]。在非胁迫条件下Fv/Fm值变化较小，但在胁迫条件下Fv/Fm值会有不同程度的下降，这是一个反映微藻生长环境良好与否的重要参数[35]。在本试验中，过高或过低质量分数NaCl均会造成Fv/Fm值下降，表明藻株处于不佳的生长状态。该藻株在NaCl质量分数为6%时生长最快，而在NaCl质量分数为3%时Fv/Fm值最高，其原因可能是最大光化学转化效率不能完全反映或严格对应不同盐胁迫条件下藻株生长的变化。尽管如此，随着NaCl质量分数的升高，这两个指标均呈现出先升后降的趋势。盐胁迫导致了光合活性下降从而引起微藻生长和生物合成所需的光合作用产物的减少，因此Fv/Fm参数可以用于快速评价不同微藻品种对盐胁迫的适应性，也可作为预测在盐胁迫条件下生物量产率变化的参考指标[2,36]。

3.2 不同质量分数NaCl对杯状藻生化组分的影响

微藻可以改变体内的细胞生化组成以响应盐胁迫环境。BenMoussa-Dahmen等[37]对亚热带双眉藻(Amphorasubtropica)的研究表明，随着NaCl浓度由0.25 mol/L升至5.00 mol/L，硅藻碳水化合物含量呈现出先升后降的趋势。这种变化趋势与本试验结果一致。高盐环境可能限制了碳水化合物的累积或消耗更多碳水化合物提供额外能量以抵御盐胁迫[2,38]。过高或过低盐度均会导致蛋白含量降低，其原因可能是盐胁迫条件下藻类生长受到抑制[37,39]。刘梅等[1]研究表明，在盐胁迫下，如果藻细胞的光合作用并未受明显抑制，其蛋白质含量也无变化。本试验结果表明，在NaCl质量分数为1.5%～9%时，杯状藻藻株的可溶性蛋白含量无明显变化，但在NaCl质量分数高于12%时，可溶性蛋白含量和光合活性均有明显下降且生长受到严重抑制。依据硅藻种类和试验条件不同，细胞脂肪含量和组成在盐度水平变化后发生相应的改变[12,40]。本试验结果表明，当盐含量升至一定值时，该藻株的脂肪含量也随之增加；但当盐含量超过一定值时，脂肪含量反而会降低[41-42]。许多藻类可以在不利条件下倾向于通过改变脂质合成途径形成和积累游离脂肪酸来贮存脂质而不是形成结构脂类化合物[41,43]。研究表明，脂肪合成相关基因的表达 (如脂肪合成的关键基因乙酰辅酶A合成酶)在盐胁迫下明显上调，因此适度的盐胁迫有利于脂肪的形成[44-45]。但在较强盐胁迫条件下藻类脂肪含量降低，其可能原因是在盐胁迫条件下藻类增强了呼吸作用并消耗贮存的脂类物质为这一过程提供额外能量来源[2]。已有的研究表明，硅藻的主要脂肪酸为肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1)和二十碳五烯酸(C20:5)[46]，这与本试验结果基本一致。生物柴油中最为常见的C16和C18脂肪酸，如棕榈酸 (C16:0)、棕榈油酸 (C16:1)、硬脂酸 (C18:0)、油酸(C18:1)。在不同质量分数NaCl下，杯状藻藻株C16和C18脂肪酸含量占总脂肪酸含量的73.60%～80.57%。高盐或低盐胁迫条件下，亚热带双眉藻、盐生杜氏藻 (Dunaliellasalina)和杜氏藻 (Dunaliellasp.) 细胞中不饱和脂肪酸的含量会下降[37,47]。与前述研究结果相似，该杯状藻多不饱和脂肪酸含量随NaCl质量分数的增加呈现先升后降的趋势，在NaCl质量分数为6%时最高。该藻株中主要的多不饱和脂肪酸组分为营养价值较高的二十碳五烯酸(C20:5)，最高可占总脂肪酸含量的20.92%。脂肪酸对于水产养殖动物的生长发育至关重要。多不饱和脂肪酸是海水仔鱼、虾蟹贝幼体的必需脂肪酸，关系到仔鱼和幼体的生长和存活[48-49]。有研究表明，在饲料中添加富含多不饱和脂肪酸的微藻粉可以降低幼鱼的血脂水平和脂肪沉积，促进蛋白质合成，有利于幼鱼的生长发育[50-51]。因此，杯状藻FACHB-2450可以作为生物饵料进行大量培养，为水产动物幼体提供丰富的必需脂肪酸二十碳五烯酸。

4 结 论

本试验分离得到一株耐盐的杯状藻FACHB-2450，其在NaCl质量分数为6%时，藻细胞生长最快，在培养末期生物量达1.79 g/L，多糖含量可达细胞干质量的9.96% (NaCl质量分数为6%)，可溶性蛋白量占细胞干质量的23.65%且在较宽盐度范围下含量变化不大，总脂含量可达细胞干质量的32.46% (NaCl质量分数为3%)，二十碳五烯酸(C20:5) 含量可占总脂肪酸含量的20.92%(NaCl质量分数为9%)。

试验结果初步表明，杯状藻FACHB-2450是一株可以适应高盐环境且在较宽的NaCl质量分数范围内均可较好生长的硅藻藻株，其富含油脂、多不饱和脂肪酸二十碳五烯酸和蛋白。该藻株能够广泛培养在半咸水(如河口、咸水湖泊)、海水甚至高盐(如盐碱滩涂)生境中，可以作为水产动物育苗用的饵料微藻或综合开发高值产物的潜在优良藻株。

致 谢

感谢中国科学院水生生物研究所藻种资源与藻类毒理学学科组卢哲博士在生化组分测定试验方法上给予的帮助，以及公共技术服务中心左艳霞高级工程师在脂肪酸分析过程中给予的技术支持。