高温应激下维生素E对红耳龟免疫指标及消化酶的影响

2022-03-20雷金洪刘天天张广武傅丽容史海涛

水产科学 2022年2期

雷金洪，刘天天，张广武，傅丽容，史海涛

( 海南师范大学生命科学学院，热带岛屿生态学教育部重点实验室，海南海口 571158 )

红耳龟(Trachemysscriptaelegans)具有食用、药用及观赏价值，自1987年引入我国以来，因生命力顽强，易饲养，价格低廉，一直受到养殖户的青睐。红耳龟最适养殖温度为30 ℃，在集约化大规模养殖过程中，气候变暖和极端天气频发的情况下，夏季高温已成为影响龟鳖健康养殖的重要因素。研究显示，高温胁迫引发的热应激直接影响机体功能，导致代谢障碍、生长迟缓、免疫力下降，引发各种病害，造成巨大的经济损失[1-2]。因此缓解、降低热应激的不利反应，是龟鳖养殖亟待解决的问题。

维生素E是一种有效的抗氧化剂和免疫增强剂，在水产养殖中已得到广泛应用。维生素E可以改善水生生物饲料利用率，提高水生生物的生长速度，增强细胞免疫和体液免疫功能[3]。在大量鱼类的相关研究表明，缺乏维生素E会使鱼营养不良，降低鱼的应激能力、生长率和成活率[4]。Alves等[5]研究发现，大西洋庸鲽(Hippoglossushippoglossus)在热应激情况下血糖、血清皮质酮水平升高，热应激蛋白(Hsp70)基因的表达量升高；而饲料中添加维生素E能降低热应激状态下大西洋庸鲽的血糖和血清皮质酮水平，下调热应激蛋白基因的表达，说明维生素E是一种有效的抗应激剂。维生素E的抗应激效应与添加量密切相关，不同种属水产动物对维生素E的最适需求量有一定的差异，在适宜范围内有促进作用[6]。点带石斑鱼(Epinepheluscoioides)幼鱼[7]最适维生素E需求量为139.68～149.59 mg/kg；中华鳖(Pelodiscussinensis)[8]在养殖过程中补充维生素E 250～350 mg/kg，足以承受不利的环境，而高水平的维生素E抑制幼鳖的生长。高温胁迫环境下能否通过添加维生素E增强红耳龟幼龟的抗应激能力，提高生产性能，及维生素E的适用量范围等相关研究未见报道。笔者拟在饵料中添加不同水平的维生素E，以(34±0.5) ℃水温为应激源，探讨不同剂量维生素E对高温应激下红耳龟血清中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性、丙二醛含量及肠道消化酶活性的影响，以期改善龟鳖动物抵抗高温环境的能力，为生产实践中合理利用维生素E提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验动物及驯化

试验用红耳龟幼龟，购于海口市东山泓旺养殖场，暂养于实验室玻璃缸中。每2 d于18：00投喂1次，所用饲料为龟鳖配合饲料(营养成分见表1)，将饵料加少量水和成面团后投喂，投饵量以使动物达到饱食并出现少量剩余为准。驯养2周，使试验用龟充分适应环境后，挑选健康个体开始试验。

表1 基础日粮主要营养成分及其含量 %Tab.1 Approximate nutrient ingredient and contents of basal diet

1.2 试验设计

选取40只红耳龟幼龟健康个体，体质量(108.42±19.56) g，随机分为4组，每组2个平行，每个平行5只，各组间体质量差异不显著(P>0.05)，置于48 cm×36 cm×10 cm的饲养箱中，试验期间条件控制与驯化相同。试验组动物饵料中除维生素E添加量不同外，其他营养条件均与对照组相同，对照组不添加维生素E，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组饲料维生素E的添加量分别为150、250、350 mg/kg。试验30 d后，断颈取血液样品，4 ℃、3500 r/min(离心半径8.56 cm)下离心获得血清，用于测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性及丙二醛含量。同时，解剖取肠道组织，加入9倍体积的磷酸缓冲盐溶液，制成匀浆液，用于测定肠道消化酶活性。

1.3 特定生长率测定

正式试验前测定红耳龟幼龟初始体质量(m1)，饲养试验结束后称量幼龟终末体质量(m2)，试验周期为t，特定生长率(RSG，%/d)参照文献[7]进行计算：

RSG=(lnm2-lnm1)/t×100%

1.4 抗氧化指标测定

试验选用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒，测定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。其中超氧化物歧化酶活性检测采用羟胺法，过氧化氢酶活性选用可见光法测定，丙二醛含量则是通过硫代巴比妥酸法测定。

1.5 肠道消化酶活性测定

肠道消化酶活性测定过程中，淀粉酶选用碘—淀粉比色法，根据淀粉遇碘变蓝原理，依据试剂盒说明书按要求分步加入样品、相关试剂，混匀，在660 nm波长处测得吸光度，通过计算得出样品淀粉酶活性；脂肪酶活性的测定采用甘油三酯法；蛋白酶活性的测定方法采用氨基酸法。3种酶均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒在37 ℃条件下进行检测，具体操作方法严格按照说明书进行。

1.6 数据处理及分析

数值均用平均值±标准差表示。采用F检验或Bartletts检验各组方差齐性，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，不同处理间多重比较采用LSD法进行差异显著性检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 不同维生素E水平对红耳龟幼龟特定生长率的影响

高温应激环境中，未添加维生素E的对照组红耳龟特定生长率最低，试验组饲喂日粮中添加维生素E可以促进红耳龟特定生长率的增长。由图1可见，150 mg/kg试验组特定生长率比对照组高，但差异不显著(P>0.05)，250、350 mg/kg试验组特定生长率升高明显，显著高于对照组(P<0.05)，说明维生素E可以缓解高温应激，有助于红耳龟幼龟的生长。

图1 饲料维生素E水平对红耳龟特定生长率的影响Tab.1 Effect of vitamin E levels on specific growth rate (SGR) of red-eared turtle T. scripta elegans不同组别上标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P<0.05).Means with the same superscript in the different groups are not significant differences (P>0.05), and the means with different superscripts are significant differences (P<0.05).

2.2 不同维生素E水平对红耳龟幼龟血清抗氧化指标的影响

高温胁迫环境下添加不同水平维生素E日粮饲喂红耳龟幼龟，血清抗氧化酶活性有不同程度的提高，250 mg/kg试验组血清超氧化物歧化酶活性显著高于对照组和150 mg/kg试验组，差异极显著(P<0.01)；3个试验组血清过氧化氢酶活性升高幅度较大，约为对照组的3.5倍[F(3，36)=47.81，P<0.01]，各试验组间差异不显著(表2)。丙二醛含量与抗氧化酶活性呈负相关，对照组含量最高，不同水平维生素E试验组的丙二醛含量均显著低于对照组[F(3,36)=27.61，P<0.01]，各试验组间差异不显著(P>0.05)，但250 mg/kg试验组降低幅度最大。说明高温胁迫环境下，在红耳龟幼龟日粮中添加一定水平的维生素E可以提高机体抗氧化能力，应对高温胁迫。

表2 饲料维生素E水平对红耳龟抗氧化指标的影响(平均值±标准差，n=10)Tab.2 Effect of vitamin E levels on antioxidant index of red-eared turtle T. scripta elegans (means±SD, n=10)

2.3 不同维生素E水平对红耳龟幼龟肠道消化酶活性的影响

高温应激下日粮中添加不同水平的维生素E饲喂红耳龟30 d后，试验组肠道3种消化酶出现不同程度的变化。与对照组相比试验组淀粉酶活性有所降低，但无差异显著性[F(3,36)=1.15,P>0.05](表3)。试验组脂肪酶活性均显著低于对照组[F(3,36)=6.58,P<0.01]，250 mg/kg试验组与对照组相比差异极显著(P<0.01)。蛋白酶活性变化与淀粉酶和脂肪酶活性变化相反，试验组蛋白酶活性显著高于对照组[F(3,36)=4.31,P<0.05]，250 mg/kg试验组蛋白酶活性最高，约为对照组的3.5倍(P<0.01)，350 mg/kg试验组蛋白酶活性下降，与对照组差异不显著。说明不同水平的维生素E会影响红耳龟幼龟消化功能。

表3 维生素E水平对红耳龟消化酶活性的影响(平均值±标准差，n=10) U/mgTab.3 Effect of vitamin E levels on the digestive enzyme activities of red-eared turtle T. scripta elegans (means±SD, n=10)

3 讨论

3.1 维生素E对红耳龟幼龟生长性能的影响

夏季高温常导致水产动物产生热应激，热应激条件下体内肾上腺素和皮质醇大量分泌，使机体分解代谢加强，合成代谢减弱[9]，此外，应激可能还通过减少食物的摄入、吸收和利用影响生长[10]。如果在动物饲料中加入一定量的维生素E会使动物快速生长[11]。在中华鳖的日粮添加维生素E，显著提高中华鳖的质量增加率、饲料利用率和蛋白利用率[12]。普遍认为维生素E能促进动物肠道的发育，提高动物的消化酶活性，从而促进营养物质的消化吸收，提高生长性能[13]。本试验结果进一步证实了上述观点，在高温应激情况下当维生素E的添加量达250 mg/kg时，可促进生长性能的提高，这可能与改善红耳龟幼龟消化吸收功能有关。另外，环境高温导致的热应激可直接影响消化道的结构，宁章勇等[14]发现，持续34.5 ℃高温导致肉鸡肠绒毛断裂，胃肠黏膜上皮细胞脱落及腺胃、十二指肠、空肠和回肠黏膜完整性损伤。郑婷[15]研究表明，饲料中添加维生素E可促进鲤(Cyprinuscarpio)肠上皮细胞的增殖，完善鲤肠上皮细胞的发育，并保护其功能和结构的完整性。因此，本试验中，当维生素E添加量达350 mg/kg时，红耳龟消化酶活性下降，生长性能仍显著提高，可能与维生素E对幼龟肠道的保护和修复，加强绒毛上皮细胞的吸收有一定的关系，但还需进一步研究。

3.2 维生素E对红耳龟幼龟抗氧化能力的影响

抗氧化酶是生物体内保护预防相关的酶类，研究表明，当动物受到热应激侵害时，机体内的过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性均会受到影响[16]。徐冬冬等[17]研究发现，褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)长期在海水中受高温胁迫，肝脏组织超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性随着胁迫温度的上升而下降，存活率降低。胁迫环境下抗氧化酶活性降低，大量的自由基不能及时清除，会给组织和细胞造成氧化性损伤。本试验得到类似的结果，未添加维生素E的热应激组超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性最低，添加维生素E达适宜剂量时两种酶活性显著提高，丙二醛含量显著减少，说明维生素E在终止脂质过氧化反应及消除自由基等方面表现出良好的效果。有学者认为，维生素E可能会替代体内和细胞膜上的不饱和脂肪酸与自由基反应，从而使不饱和脂肪酸免受氧化，对维护生物膜的正常生理功能起到十分重要的作用[18]。

3.3 维生素E对红耳龟幼龟消化能力的影响

消化酶是动物机体对饲料中营养物质消化吸收的关键物质，其活性与动物生长密切相关。高温应激会影响水生动物消化酶的活性，罗祖娟等[19]研究发现，高温胁迫下吉富罗非鱼(OreochromisniloticusGIFT)肠道胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，随胁迫时间的延长，呈先升后降的趋势。维生素E对水生动物消化功能的改善常见报道，伍曦等[20]研究表明，在高温胁迫情况下，饵料中添加高水平的维生素E能促进建鲤(C.carpiovar.Jian)幼鱼生长和消化器官生长发育，并增强建鲤幼鱼的消化吸收能力。对泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)的消化酶影响研究结果显示，维生素E显著提高泥鳅幼鱼肠道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，达到适宜维生素E水平(195 mg/kg)肠蛋白酶和肠脂肪酶活性的变化几乎相反[21]。本试验结果显示，添加维生素E显著影响红耳龟幼龟蛋白酶和脂肪酶活性，蛋白酶活性显著提高，250 mg/kg试验组蛋白酶活性最高，脂肪酶的活性受到抑制，提示日粮中添加适量维生素E有利于蛋白酶的分泌。说明不同维生素E对动物生长的影响存在种属和剂量上的差异。由红耳龟野外食性研究和人工饲养结果可知，红耳龟成体属杂食性，喜肉食饵料，幼体属肉食性[22]，本试验结果提示，红耳龟幼龟人工饲养条件下，日粮中添加维生素E可促进蛋白质的消化分解，同时饵料成分的配伍上应加大蛋白质占比，减少脂肪占比。