天蚕素抗菌肽在饲料应用中的安全性研究

孙明杰 ， 盛永杰， 郝木强， 赵 倩， 柳亚茹， 谢全喜， 曹银生

（山东宝来利来生物工程股份有限公司，山东省动物微生态制剂重点实验室，山东泰安 271000）

为避免抗生素滥用给人类健康带来的多种危害， 寻找代替传统抗生素的药物已成为现今研究热点。近几年随着抗菌肽研究的不断深入，发现其作为抗菌的替代药物发展潜力巨大。 由于抗菌肽独特的抑菌机理， 病原微生物不易对其产生耐药性，使其成为一种新型的抗微生物介质。 另外，由于抗菌肽具有广谱抗菌性、 耐酸碱、 热稳定等特征，使其在医药、农业、养殖业、食品工业等领域展现出广阔的应用前景和研究价值。 目前关于抗菌肽的应用已经有很多报道（孙得发等，2020；黄小建等，2020；王正楠，2020），但作为饲料添加剂与其相关的毒性试验报道较少。 本文研究了天蚕素抗菌肽作为饲料添加剂对小鼠的急性毒性和亚慢性毒性， 为抗菌肽作为饲料添加剂在畜牧领域中的应用提供支撑数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 18 ～22 g 昆明小鼠，雌性，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 主要试剂 抗菌肽菌粉CEC-38，27 万单位/g，由宝来利来生产车间提供。 含有不同剂量抗菌肽鼠粮由济南朋悦实验动物繁育有限公司代加工。

1.3 小鼠急性毒性试验

1.3.1 动物分组及给药方法 18 ～22 g 昆明小鼠共50 只，试验共分5 组，每组小鼠10 只。 1 ～5组采用一次最大灌胃量法 （1 mL/只）， 空腹8 h后， 灌胃不同剂量抗菌肽（800、1600、3200、6400、12800 单位/g）。

1.3.2 观察及检测指标 动物死亡情况： 每天定期观察小鼠3 次， 包括动物死亡数及各自的死亡时间。 中毒反应症状：临床观察每天至少一次，观察皮肤、被毛、眼睛和黏膜改变，呼吸、循环、自主和中枢神经系统以及四肢活动和行为方式的变化等，特别要注意有无震颤、惊厥、腹泻、嗜睡等现象。 神经毒性：惊厥、共济失调和死亡。 植物神经兴奋：腹泻或竖毛。病理学检查：解剖进行尸检，观察各器官有无改变， 对肉眼观察有变化的脏器需进行组织病理学检查。

1.4 小鼠亚慢性毒性试验

1.4.1 动物试验设计 试验共分5 组， 每组小鼠10 只，雌性。 CK 为对照组，饲喂基础饲料。 1 ～4组为试验组， 饲喂含有不同剂量抗菌肽（40、400、4000、2 万单位/g）鼠粮。 所有小鼠自由采食。 啮齿类亚慢性毒性试验时间至少3 个月（2 ～6 个月），本试验亚慢性试验进行4 个月饲喂观察。

1.4.2 检测指标 在饲喂试验开始后每日观察小鼠的表现，每周称量小鼠体重、饲料，计算日增重、日采食量、 食物利用率。 在第4 个月剖杀部分小鼠，采集主要脏器，计算脏器指数，采集小鼠血液，测定小鼠血液常规和生化指标。

2 结果

2.1 抗菌肽急性攻毒试验结果 临床观察：各组小鼠皮肤、被毛、眼睛和黏膜无改变，呼吸、四肢活动和行为方式无变化，无震颤、惊厥、腹泻、嗜睡等现象，无腹泻或竖毛。剖检：各组小鼠主要脏器，胸腺、肺、肝、脾、胃、小肠、大肠、肾等部位未发现明显病理变化。

急性攻毒试验小鼠在最大剂量为1.28 万单位/g，灌胃1 mL 时并未致死，临床观察和剖检结果说明，天蚕素抗菌肽在最大剂量时无毒性。

2.2 抗菌肽亚慢性毒性试验

2.2.1 抗菌肽对小鼠临床表现的影响 临床观察：各组小鼠皮肤、被毛、眼睛和黏膜无改变，呼吸、四肢活动和行为方式无变化，无震颤、惊厥、腹泻、嗜睡等现象，无腹泻或竖毛。

2.2.2 抗菌肽对小鼠日增重的影响 饲喂试验开始前2 个月，每周称量小鼠体重，计算小鼠的日增重，后期延长称重时间。 结果如图1 显示，前4 周小鼠生长较快，后期小鼠日增重变化不大，小鼠基本停止生长。 CK 组和试验1、2、3、4 组间日增重无显著差异（P＞0.05）。 表明饲喂抗菌肽并未影响小鼠的正常生长。

图1 天蚕素抗菌肽对小鼠日增重的影响

2.2.3 抗菌肽对小鼠日采食量的影响 饲喂试验开始前2 个月，每周称量小鼠采食量，计算小鼠的日采食量。试验后期延长称量时间。由图2 可知，试验组1 ～4 组小鼠饲喂抗菌肽后前5 周日采食量显著低于对照组（P＜0.05）。 从第6 周开始，除4 组外，各组日采食量与对照组差异不显著（P＞0.05），1 ～3 组日采食量逐渐与对照组相当，4 组采食量一直保持最低。

图2 天蚕素抗菌肽对小鼠日采食量的影响

2.2.4 抗菌肽对小鼠食物利用率的影响 通过小鼠日增重与日采食量之比，计算小鼠食物利用率。由图3 可知，小鼠食物利用率随饲喂时间延长，各组呈现降低趋势。第1 周，各试验组显著低于对照组（P＜0.05）。 饲喂抗菌肽提高了食物利用率。 除第8 周和第16 周，4 组小鼠食物利用率一直显著高于其他各组（P＜0.05）。 1 ～3 组小鼠食物利用率也高于对照组。

图3 天蚕素抗菌肽对小鼠食物利用率的影响

2.2.5 抗菌肽对小鼠脏器指数的影响 饲喂4 个月后，各组剖杀10 只小鼠。采集小鼠主要器官，进行数据分析。 脏器指数是指某个脏器的湿重与单位体重的比值，通常以100 g 体重计。 如肝/体比，即（全肝湿重/体重）×100。 由表1 可知，饲喂不同浓度抗菌肽4 个月对小鼠主要脏器指数无显著性影响（P＞0.05）。 并且剖检并未观察到器官病变。

表1 抗菌肽对小鼠脏器指数的影响（n=10）g

2.2.6 抗菌肽对小鼠血液生化指标的影响 饲喂4 个月后， 剖杀， 毛细管采集小鼠血液20 μL 于1.5 mL 抗凝离心管中， 送于骨科医院进行测定，数据分析结果如表2。 饲喂不同浓度抗菌肽4 个月对小鼠谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮无显著性影响（P＞0.05）。 说明抗菌肽对小鼠肝、肾功能无影响。

表2 抗菌肽对小鼠血液生化指标的影响（n=10）

2.2.7 抗菌肽对小鼠血常规的影响 眼球采血于离心管中，5000 r/min 离心10 min ， 取上清送于骨科医院进行测定，数据分析结果如表3。 数据显示各试验组血常规各指标与CK 组相比无显著差异性（P＞0.05）。

表3 抗菌肽对小鼠血常规的影响（n=10）

3 讨论

毒理研究中动物的体重变化是机体各器官、系统发育状况的总和， 是反映受试毒物对机体毒性作用的一项综合指标， 对于判断受试物毒性作用强度有一定的参考价值（沈建忠，2002）。因大多数雌性动物耐受性强于雄性，且个体之间差异小，故选用雌性小鼠进行试验。

为了减少用药应激，亚慢性毒性试验周期持续4 个月，试验周期较长，因此采用混饲给药方式， 将抗菌肽按照比例添加到饲料中， 重新制粒，最大程度减少应激反应，可更好地检验相关指标。 饲喂试验开始前，粉碎各组代加工饲料，测定代加工饲料抗菌肽活性是否受损， 确保试验的严谨性。

小鼠2 ～6 个月饲喂试验可以作为评价药物或毒物亚慢性危害的主要参考依据。 本试验通过混饲给药观察小鼠的临床表现、 组织病理学变化，以及测定血液学、血清生化指标、脏器系数等几个方面来考察抗菌肽毒性（姜玲玲等，2016；苏亚楠等，2015；张玲等，2004）。 脏器系数又称脏体比， 是试验动物某脏器的重量与体重之比值。 脏器系数常能反映试验动物总的营养状态和内脏的病变情况，脏器系数增大，表示脏器充血、水肿或增生肥大等；脏器系数减小，表示脏器萎缩及其他退行性改变。 正常状态下，脏器系数比较恒定， 当接触外来物质致使脏器受到损害，脏器重量发生改变，脏器系数将发生变化（孙全文等，2010）。 本试验结果表明，长期饲喂含天蚕素抗菌肽饲料，小鼠体重、血液常规指标、血液生化指标、脏器系数与对照组相比均无显著差异，剖检观察显示小鼠内脏器官无损害，未见与药物作用相关病理变化， 故可认定天蚕素抗菌肽作为饲料添加剂可长期使用。

另外由于试验用天蚕素抗菌肽为规模化生产获得，因此在检验急性毒性试验时未用纯品，而是直接灌胃水溶菌粉， 灌胃1.28 万单位/g 1 mL 为最大给药量， 但作为支持天蚕素抗菌肽在畜牧行业中应用试验也足以说明其安全性。

与传统抗生素杀菌方式不同， 抗菌肽具有独特的杀菌作用方式， 其能够特异性地选择结合位点， 通过降解细菌膜的某些必要成分或通过特定膜受体而进入病原体起到杀菌作用 （Schmitta ，2016），这种独特的杀菌方式，使抗菌肽在饲料应用中具有安全、绿色、高效等优势。

4 结论

本试验结果表明， 饲喂不同浓度抗菌肽小鼠的前期采食量显著下降，后期逐渐趋于对照组，整个饲喂周期日增重与对照组差异不显著， 食物利用率显著升高；小鼠的临床表现、脏器指数、血液常规指标和血液生化指标均与对照组差异不显著。 天蚕素抗菌肽对小鼠生长有积极的生物学影响，未见毒性。