多位点序列分型技术在凝结芽孢杆菌菌株分类中的应用

冯海霞， 王金龙 ， 吕 伟， 刘胜利， 马艳艳

（1.青岛尚德生物技术有限公司，山东青岛 266111；2.山东隆科特酶制剂有限公司，山东临沂 276400）

凝结芽孢杆菌属于芽孢杆菌目、芽孢杆菌科、芽孢杆菌属，具有耐酸、耐胆盐、耐温，可产生L-乳酸和凝固素， 并且可以在肠道内定植等优良特性，目前已经在国内外得到广泛应用，既可以作为保健、药品应用到人体，也可以作为饲料添加剂应用到动物生产中。

目前，国内外有多株凝结芽孢杆菌菌株，通过16S rRNA 基因测序鉴定到凝结芽孢杆菌种， 但凝结芽孢杆菌不同菌株之间如何区分，目前鲜见文献报道。多位点序列分型技术（MLST）是由Maiden 等（1998）学者提出的，该技术多用于病原菌菌株间分类鉴定（吕国平等，2013；杨瑞複，2009），随着技术的成熟和分子生物学的发展，逐渐用于多种菌株的鉴定（徐海燕等，2013）。 MLST 分型技术以相对保守的多个管家基因（一般5 ～8 个）为依据，通过对每个管家基因的测序分型，对各菌株亲缘关系进行分析。 本试验选用了15 株国内凝结芽孢杆菌菌株和1 株参考菌株DSM 1， 利用MLST 分型技术对16 株菌株进行分型， 并利用系统发育技术对各菌株之间的亲缘关系进行分类鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料 青岛根源生物集团菌库10 株菌株， 编号：G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6（E32）、G-7、G-8、G-9、E21（该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行专利菌株保藏，编号CGMCC No.13044）；国内市场凝结芽孢杆菌产品分离菌株5 株， 编号：Y1、Y2、Y3、Y4、Y5； 参考菌株1 株：Bacillus coagulansDSM 1 ＝ATCC 7050（简称DSM 1）。

1.2 主要试剂与仪器 菌培养试剂：MRS 固体培养基、MRS 肉汤， 均购自北京陆桥技术有限责任公司。 菌株基因组DNA 提取及扩增试剂，细菌基因组提取试剂盒，Masster Mix，Maker 2000 均购自北京博迈德生物技术有限公司。基因扩增仪：上海领成生物科技有限公司，型号TCT5；恒温培养振荡器： 上海智城分析仪器制造有限公司， 型号ZWY-2102；隔水式恒温培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂，型号GSP-9080MBE；台式高速冷冻离心机：Eppendorf Centrifuge 5810R；凝胶成像系统：美国Biorad 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 引物合成 参考PubMLST 库（网站http://pubmlst.org/） 对地衣芽孢杆菌 （Bacillus licheniformis）的报道，在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下载凝结芽孢杆菌参考菌株DSM 1 和地衣MLST 中相同管家基因的序列， 然后通过CE Design V1.04 软件设计凝结芽孢杆菌的相关引物，引物通过上海生工合成。 引物序列如表1。

表1 凝结芽孢杆菌5 个管家基因的引物

1.3.2 菌株培养及核酸提取 凝结芽孢杆菌菌株经MRS 固体培养基，37 ℃培养48 h，多次划线纯化，直到得到单一的菌落形态为止。然后挑取纯化后的各菌株平板上的单菌落至灭菌好的MRS 液体试管中，37 ℃静置培养24 h，取1 mL 培养液用细菌基因组提取试剂盒提取不同凝结芽孢杆菌菌株的基因组DNA。

1.3.3 PCR 扩增及电泳分析 16S rRNA 基因扩增，用27F&1492R 细菌通用引物扩增，扩增片段经1%琼脂糖凝胶确认有清晰条带后， 送往生工生物工程（上海）有限公司测序。 管家基因序列扩增：用表1 中的引物以提取的DNA 为模板，加入1×Masster Mix 和管家基因的前后端引物， 进行PCR 扩增。 管家基因PCR 反应体系25 μL：DNA模板1 μL，1×Masster Mix 22 μL， 引物F、R 各1 μL。管家基因PCR 扩增程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。 扩增片段经1.2%琼脂糖凝胶确认有清晰条带后，送往生工生物工程（上海）有限公司测序。

1.3.4 测序结果比对及系统发育分析 各菌株不同管家基因的测序序列经过DNAMAN 软件比对，把前后测序不合适的片段进行删除编辑，然后按adk-recF-sucC-rpoB-spoOA顺序串联起来，经CLUSTAL 软件处理后， 用MEGA6.0 软件做成进化树分析。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA 基因系统进化树 所有试验菌株均做了16S rRNA 基因鉴定，BLAST 比对发现和Bacillus coagulans的相似性菌均在99%以上，选取部分菌株的16S rRNA 序列和参考菌株DSM1 的16S rRNA（NR_115727.1）做系统进化树分析，结果如图1 所示，试验的15 株菌株用16S rRNA 序列同源性在99.9%以上， 无法较好地区分开。

图1 凝结芽孢杆菌菌株16S rRNA 基因进化树

2.2 MLST 分析系统进化树 试验菌株的5 个管家基因测序情况如表2 所示， 剪辑后的片段大小集中在550 ～1064 bp， 将管家基因按adkrecF-sucC-rpoB-spoOA的顺序串联后，总长度为4010 bp 左右，多态性位点总数为132 个。 串联后序列经CLUSTAL 软件处理后用MEGA6.0 做进化树，如图2 所示，结果发现，青岛根源生物集团菌库10 株和市场菌株Y1、Y2 聚为一类，Bootstrap 值≥99； 市 场 菌 株Y3、Y4、Y5 聚 为 一 类，Bootstrap 值≥99， 其中Y4 和Y3、Y5 略有不同，Bootstrap 值偏低，只有47；参考菌株DSM1 为第三类。 MLST 分析结果中菌株间相似性明显低于16S rRNA 结果，不过参考菌株DSM1 仍与国内其他菌株亲缘关系较远。

表2 15 株不同凝结芽孢杆菌菌株MLST 结果统计

图2 基于MLST 分型的凝结芽孢杆菌菌株系统进化树

3 讨论

凝结芽孢杆菌具有乳酸菌和芽孢菌的双重特性， 试验开始借鉴植物乳杆菌和双歧杆菌等乳酸菌的相关报道（刘洋等，2017；冯淑贞，2016；江建平等，2015）， 试图寻找适合凝结芽孢杆菌不同菌株区分的管家基因，试验发现都不可行。后来参考蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌（刘阳等，2018），发现地衣芽孢杆菌的MLST 分析的管家基因更适合凝结芽孢杆菌不同菌株区分。

16S rRNA 基因测序能从大的范围内确定该菌株是否为凝结芽孢杆菌， 但是菌株间相似性普遍高于99%，差异性极小无法区分。 MLST 技术采用多个管家基因，基因长度一般在400 ～800 bp，可操作性强、重复性好、分辨率高。 因而MLST 技术可作为种内分型的强有力工具， 能够清晰解析菌株间的系统发育关系。 虽然目前MLST 数据库没有关于凝结芽孢杆菌的ST 型， 相信随着益生菌的快速研究发展，会逐步建立和完善。

目前市面上商业化的凝结芽孢杆菌产品参差不齐， 如果想鉴别真伪， 可通过分离纯化菌株做16S rRNA 鉴定。 但16S rRNA 技术的局限性在于无法区分种内不同菌株间的差异性。 本试验选取国内有代表性的15 株凝结芽孢杆菌菌株，并参考NCBI 中凝结芽孢杆菌菌株DSM1，通过5 个管家基因，adk、recF、sucC、rpoB和spoOA的扩增，测序结果拼接串联后，做系统进化树发现，国内大部分菌株G1-G9、E21 和Y1、Y2 为同一类别（Bootstrap值≥99），Y3、Y4、Y5 三个菌株为第二类别（Bootstrap 值≥99）， 参考菌株DSM1 和国内凝结芽孢杆菌菌株差异较大为第三类。 本文从分子生物学方面入手， 避免传统生理生化试验的繁琐和不确定性， 可为益生菌从业者及益生菌生产企业提供一定参考。