牛大力总酚酸提取工艺优化、定量分析及抗氧化活性研究

石敏，吴桂妮，蓝淼杏

广西农业职业技术大学食品工程系（南宁 530007）

牛大力为豆科崖豆藤属植物，富含黄酮类、生物碱、多糖、酚酸类、甾醇类等活性成分，营养价值和药用价值极高[1-4]。据报道，牛大力具有养肾补虚、强筋活络、平肝和润肺之功效[5-6]。南方地区常用牛大力熬汤、制酒，味道甘香甜口、口味极佳。近年来，随着人们保健意识和食疗意识的提高，牛大力及其深加工产品深受人们的喜爱[7-9]。

酚酸类化合物广泛分布于中草药中，其在抗菌消炎、抗氧化、抗癌、降血糖血脂和治疗心血管疾病等方面具有一定的药理作用[10-14]。酚酸含量的测定方法主要有分光光度法、高效液相色谱法、质谱法和毛细管电泳法[15-19]。其中，色谱法前处理步骤繁琐，质谱法耗费高，毛细管电泳法重现性差。相对而言，分光光度法操作简单、准确快速。关于牛大力中酚酸类化合物的研究仅局限于物质的提取分离鉴定。

试验采用超声波辅助提取法对牛大力总酚酸进行提取，通过正交试验优化，得到最优酚酸提取工艺；采用分光光度法，通过单因素试验优化，得到最优酚酸测定条件，并对该方法学进行考察；通过自由基清除试验考察牛大力酚酸的抗氧化能力。试验以期为牛大力深加工、质量控制和价值开发提供借鉴，以推动现代保健食品深加工产业的发展。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛大力采自广西南宁、钦州、北海、玉林、百色、柳州等多地，经广西药用植物园彭玉德高级工程师鉴定为豆科植物美丽崖豆藤的根薯部；用水洗净后晾干，于50 ℃烘箱中烘至恒重，粉碎，保存于干燥器中。

没食子酸对照品（纯度≥98%，合肥博美生物科技有限责任公司）；福林酚（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；碳酸钠和无水乙醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）；1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基（DPPH·，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司）；2, 2’-二氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·，纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司）；抗坏血酸（纯度≥99%，成都市科龙化学品有限公司）。

1.2 仪器与设备

UV-2601双光束紫外可见分光光度计[北京北分瑞利分析仪器（集团）有限责任公司]；电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TDL-40B台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HWS-24电热恒温水浴锅（上海齐欣科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 供试液的制备

牛大力粉末→乙醇浸泡→超声提取→离心并收集上清液→重复提取并合并上清液→供试液

1.3.2 样品含量的测定及计算

将供试液稀释数倍，准确移取1 mL供试液，加水至5 mL，加入福林酚试剂和20%碳酸钠溶液，用水定容至10 mL，水浴加热，速冷，测定吸光度，并按式（1）计算样品中总酚酸的提取量。

式中：X为总酚酸提取量，mg/g；ρ为根据标准曲线计算得到的总酚酸质量浓度，mg/mL；V为待测液体积，mL；N为样品稀释倍数；m为样品质量，g。

1.3.3 牛大力总酚酸提取工艺优化

1.3.3.1 单因素试验考察

准确称取1.000 0 g牛大力粉末，依次考察料液比（1∶30，1∶40，1∶50，1∶60和1∶70 g/mL）、乙醇体积分数（30%，40%，50%，60%和70%）、超声功率（250，350，400，450和500 W）、超声温度（30，40，50，60和70 ℃）、超声时间（10，30，60，90和120 min）和超声次数（1，2和3次）对总酚酸提取量的影响。

1.3.3.2 正交优化试验考察

基于单因素试验结果，采用L9(34)正交试验优选提取条件，选取的四因素及三水平见表1。

表1 正交试验的因素及水平

1.3.4 牛大力总酚酸测定条件优化

准确移取0.5 mL 0.2 mg/mL没食子酸对照品贮备液，依次考察福林酚用量（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL）、反应放置时间（0，1，5，10和15 min）、20%碳酸钠溶液用量（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mL）、水浴温度（40，50，60，70和80 ℃）和水浴时间（10，20，30，40和50 min）对吸光度的影响。

1.3.5 牛大力总酚酸抗氧化活性研究

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力的测定

分别移取2 mL 0.010，0.025，0.050，0.100，0.150，0.200和0.250 mg/mL的供试液，加入2 mL 0.1mmol/L DPPH溶液，避光处反应30 min，在517 nm处进行测定，所得吸光度标记为A样品；移取2 mL无水乙醇，加入2 mL DPPH溶液，按上述方法进行测定，所得吸光度标记为A空白；分别移取2 mL上述不同浓度的供试液，加入2 mL无水乙醇，按上述方法进行测定，所得吸光度标记为A对照。其中，无水乙醇作为参比，维生素C作为阳性对照。DPPH自由基清除率按式（2）计算。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力的测定

参考李斌等[20]的方法制备ABTS工作液。分别移取1 mL与1.3.5.1小节相同浓度的供试液，加入2 mL ABTS工作液，在734 nm处进行测定，所得吸光度标记为A样品；移取1 mL无水乙醇，加入2 mL ABTS工作液，在734 nm处进行测定，所得吸光度标记为A空白。其中，无水乙醇作为参比，维生素C作为阳性对照。ABTS自由基清除率按式（3）计算。

2 结果与讨论

2.1 牛大力总酚酸提取的单因素试验

2.1.1 料液比对牛大力总酚酸提取量的影响

如图1所示，总酚酸提取量随液比增大呈现先增后减的趋势，说明提取溶剂体积对提取的影响相当显著。当酚酸物质溶出量达到饱和时，继续增大溶剂体积导致总酚酸提取量减小。因此，最佳料液比为1∶60 g/mL。

图1 料液比对总酚酸提取量的影响

2.1.2 乙醇体积分数对牛大力总酚酸提取量的影响

如图2所示，总酚酸提取量与乙醇体积分数之间先呈现正相关后变成负相关的情况。负相关时提取量减小的原因是较大体积分数的乙醇可溶出更多的醇溶性杂质，从而限制了酚酸物质的溶出。因此，最佳乙醇体积分数为50%。

图2 乙醇体积分数对总酚酸提取量的影响

2.1.3 超声功率对牛大力总酚酸提取量的影响

如图3所示，超声功率增大引起总酚酸提取量增加，这是因为功率越大，空化效应越剧烈，细胞破坏率增加，易于酚酸提取。过大的超声功率反而溶出大量杂质，影响酚酸提取。因此，最佳超声功率为400 W。

图3 超声功率对总酚酸提取量的影响

2.1.4 超声温度对牛大力总酚酸提取量的影响

如图4所示：超声温度较低时，分子运动速率小，导致酚酸溶出速度较慢；超声温度升高后，分子运动速率加快，酚酸提取量明显升高；超声温度过高，一些挥发性成分会挥发损失或热不稳定的杂质会与酚酸竞争溶出，影响提取量。因此，最佳超声温度为60 ℃。

图4 超声温度对总酚酸提取量的影响

2.1.5 超声时间对牛大力总酚酸提取量的影响

如图5所示：总酚酸提取量随超声时间增加呈先增后减趋势，说明超声有利于有效成分析出；超声时间越长，细胞破碎程度越大，细胞内物质析出越多，提取量越高；超过30 min后，细胞被破坏得更细碎，析出的杂质吸附酚酸，同时部分酚酸物质会被氧化或分解，导致提取量降低。因此，最佳超声时间为30 min。

图5 超声时间对总酚酸提取量的影响

2.1.6 提取次数对牛大力总酚酸提取量的影响

如图6所示，提取次数与总酚酸提取量之间呈现正相关关系，表明提取次数越多，酚酸提取越完全。综合考虑成本和时间，最佳提取次数为2次。

图6 提取次数对总酚酸提取量的影响

2.2 牛大力总酚酸提取的正交优化试验

2.2.1 正交优化试验结果与分析

正交优化试验结果如表2所示，各因素对牛大力酚酸提取的影响主次顺序为C＞B＞A，最佳提取组合为A2B2C3，即料液比1∶60 g/mL、乙醇体积分数50%、超声时间60 min。方差分析结果如表3所示，C、B因素有统计学意义，A因素无统计学意义。

表2 正交设计试验方案与结果

表3 方差分析表

2.2.2 验证试验

按正交最佳提取组合进行3次平行试验，所得平均提取量为39.65 mg/g，SRSD为0.74%（n=3），说明此提取工艺稳定。

2.3 牛大力总酚酸测定条件优化

2.3.1 测定波长的选择

精密移取对照品贮备液和供试液各0.5 mL，按1.3.2小节方法显色，以水加显色剂为参比，在300～900 nm波长范围内进行光谱扫描，结果显示两者均在720 nm处出现最大吸收峰，因此选择720 nm作为测定波长。

2.3.2 福林酚用量对吸光度的影响

在碱性条件下，酚酸可与福林酚试剂发生氧化还原反应，生成蓝色化合物，因此福林酚用量直接影响底物显色。如图7所示，福林酚用量不足1 mL时，显色不完全。因此，福林酚用量确定为1 mL。

图7 福林酚用量对吸光度的影响

2.3.3 反应放置时间对吸光度的影响

如图8所示，加入福林酚试剂后，无需等待反应，说明此反应迅速。因此，反应放置时间确定为0 min。

图8 反应放置时间对吸光度的影响

2.3.4 20%碳酸钠溶液用量对吸光度的影响

碳酸钠溶液用量同样影响底物显色。如图9所示，当其用量为1 mL时，吸光度达到最大，说明此时底物已完全显色。因此，20%碳酸钠溶液用量确定为1 mL。

图9 碳酸钠溶液用量对吸光度的影响

2.3.5 水浴温度对吸光度的影响

水浴温度的高低直接影响酚酸类物质的稳定性。如图10所示，吸光度随着水浴温度的增加而先增后减。因此，水浴温度确定为60 ℃。

图10 水浴温度对吸光度的影响

2.3.6 水浴时间对吸光度的影响

水浴时间的长短直接影响底物的显色是否完全。如图11所示，吸光度随着水浴时间的增加而先增后减。因此，水浴时间确定为20 min。

图11 水浴时间对吸光度的影响

2.4 线性关系考察

分别准确移取0，0.05，0.10，0.20，0.40和0.60 mL对照品贮备液，按1.3.2小节方法显色，在720 nm处测定吸光度。以没食子酸的质量浓度（ρ）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线。考察结果显示，线性方程为A=119.55ρ+0.007，r=0.999 9，表明0.001～0.012 mg/mL的没食子酸与A720值呈现良好的线性关系。

2.5 精密度试验

将同一份供试液连续测定6次，所得平均提取量为39.47 mg/g，SRSD为0.16%（n=6），说明仪器精密度良好。

2.6 重复性试验

精密称取6份同一批牛大力样品进行测定。所得平均提取量为39.73 mg/g，SRSD为1.36%（n=6），说明该方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

2.7.1 显色稳定性试验

将同一份供试液分别于显色结束0～120 min内，每间隔10 min测定。所得平均提取量为39.85 mg/g，SRSD为1.57%（n=12），说明供试液在显色120 min内稳定。

2.7.2 样品稳定性试验

将同一份供试液于室温分别放置0，2，4，8，12，24，36和48 h后测定。所得平均提取量为39.47 mg/g，SRSD为2.10%（n=8），说明供试液在48 h内稳定。

2.8 加标回收试验

精密称取9份同一批牛大力样品，每3份1组，每组分别添加3个水平的没食子酸对照品，测定结果如表4所示。结果显示，该方法准确度高、回收率高。

表4 牛大力中总酚酸加标回收试验结果

2.9 样品的测定

将采自广西不同产地的14个牛大力样品进行测定。结果显示，广西不同产地的牛大力总酚酸含量略有差异，含量范围为21.17～44.22 mg/g，SRSD为0.79%～2.77%。

2.10 牛大力总酚酸抗氧化活性研究与分析

2.10.1 清除DPPH自由基能力

如图12所示，牛大力酚酸对DPPH自由基清除能力与其浓度呈现正相关关系。其中最大DPPH清除率可达95.1%。与维生素C相比，牛大力酚酸弱于维生素C。

图12 对DPPH自由基清除能力

2.10.2 清除ABTS自由基能力

如图13所示，牛大力酚酸对ABTS自由基清除能力与其浓度呈现正相关关系。其中最大ABTS清除率可达95.5%。与维生素C相比，牛大力酚酸弱于维生素C。

图13 对ABTS自由基清除能力

3 结论

试验提出牛大力总酚酸提取工艺，确定最优工艺条件：料液比1∶60 g/mL、乙醇体积分数50%、超声功率400 W、超声温度60 ℃、超声时间60 min、超声次数2次；该提取工艺可为牛大力深加工和价值开发提供借鉴。试验建立牛大力总酚酸含量测定方法，确定最优条件：测定波长720 nm、福林酚用量1 mL、反应放置时间0 min、碳酸钠溶液用量1 mL、水浴温度60℃、水浴时间20 min；该方法简单快速、准确稳定，适用于牛大力总酚酸含量的测定，可作为牛大力质量控制的定量方法。试验提供广西牛大力总酚酸含量范围，可为后续全面建立广西牛大力质量标准提供参考依据。试验研究发现牛大力总酚酸对DPPH自由基和ABTS自由基均具有较强的清除能力。综上所述，试验结果对牛大力深加工产品的开发具有重要现实意义。