细胞DNA图像自动分析技术（DNA-ICM）在宫颈癌筛查中的应用价值

姚 琼，刘秀芬，盛友华

上海市奉贤区中心医院病理科，上海 201499

据世界卫生组织2020年公布的全球癌症数据，我国每年宫颈癌的发病数约11万，占全球宫颈癌发病数的18.2%，每年死亡病例数约为5.9 万例，占全球宫颈癌死亡病例数的17.3%。

绝大多数宫颈癌都与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关，HPV DNA 检测是一种较为直接且有效的筛检方法，但敏感性高而特异性不足，同时由于HPV E6/E7 与宿主细胞核整合过程中部分病例会丢失HPV DNA 而造成假阴性；而细胞形态学检查常常受人为因素的影响，降低了结果的准确性和可重复性。

细胞DNA 图像自动（扫描）分析技术（DNAICM）是建立在基因水平上的检测方法。研究表明，细胞DNA 倍体异常是遗传基因、染色体变异的标志，对细胞学诊断与分流、细胞增殖能力、癌前病变的进展风险评估等都有客观的临床参考价值［1-2］。

随着DNA-ICM 作为宫颈癌筛查方法的不断应用，发现DNA 异倍体不仅出现在宫颈上皮内病变/宫颈癌中，在良性反应性改变内也会出现相当比例的异倍体；同时在宫颈病变（甚至是癌）虽然细胞学出现明显异型性，但其染色体DNA 倍体却没有异常改变。因此，本课题拟运用DNA-ICM、Ki-67 免疫细胞化学、HPV 检测方法对结果综合分析，探讨DNA-ICM在宫颈癌筛查中的作用与应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集上海市奉贤区中心医院2018 年妇科宫颈专科门诊宫颈癌筛查标本，其中10 例DNA 含量均为二倍体的正常宫颈组织作为对照组，192 例作为实验组：无上皮内病变或恶性病变（NILM） 69 例、低级别鳞状上皮内病变（LSIL） 30例、高级别鳞状上皮内病变（HSIL） 65 例、鳞形细胞癌（SCC） 28 例，年龄21～76岁，平均（42.2±11.4）岁。

1.2 DNA-ICM测定和DNA指数（DI）的计算方法

DNA 染色套装及分析扫描仪均来源于武汉呵尔医疗科技发展有限公司。对沉降法液基细胞制片仪制作的细胞涂片Feulgen 染色后DNA-ICM 分析，通过DI 来确定细胞倍体异常。DI=被测细胞DNA IOD 值/正常细胞DNA（G0/G1 期）IOD 平均值，以DI≥2.5为异倍体判读标准。

1.3 免疫细胞化学

Ki-67 试剂盒（克隆号MIB1，检测浓度1∶100）来源于厦门通灵生物医药科技有限公司，采用EnVisionTM二步法，EDTA 热修复。以细胞核出现棕褐色着色为阳性标准，细胞重叠或抱团不计数。

1.4 HPV检测方法及分型分组

采用PCR+导流杂交法。所用试剂来源于潮州凯普生物化学有限公司。根据HPV 的遗传特性和致瘤性的差异，将HPV 亚型分成三组：低危组（6、11、42、43、44、CP8304）、中危组（31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68）及高危组（16、18）。

1.5 统计学分析

运用 SPSS 20.0 统计软件进行数据统计。采用Pearsonχ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 DNA-ICM及HPV检测结果

DNA-ICM 及 HPV 筛 查SIL+ 的 灵 敏 度 为65.9%、84.6% （χ2=34.217，P<0.001），特 异 度 为72.5%、55.1%（χ2=10.340，P= 0.006），组间具有显著的统计学差异（表1）。

表1 DNA-ICM及HPV筛查SIL+的灵敏度、特异度Tab. 1 Sensitivity and specificity of DNA-ICM and HPV screening for SIL+

2.2 NILM、LSIL、HSIL、SCC 的DI 阈值及少量异倍体细胞数（≤2个）、平均个数、Ki-67平均阳性细胞个数

NILM、LSIL、HSIL、SCC 的DI 阈值分别为≤4、≤4、≤6、≤5，其中3 例HSIL、2 例SCC 出现DI>4，提示DI>4 对HSIL 及SCC 具有诊断价值意义；少量（≤2个）异倍体细胞的占比10.1%（7/69）、33.3%（10/30）、26.1%（17/65）、28.6%（4/28），显示在各级病变中甚至是癌都可以是少量个别的异倍体；异倍体细胞的平均个数分别为0.9、3.9、9.4、12.0，Ki-67 的阳性细胞平均个数3.1、10.5、88.6、255.6，组间具有显著性差异（χ2=14.680，P<0.05），显示随着病变进展，异倍体细胞和Ki-67阳性细胞平均数量均表现为逐级增多（表2，图1、2）。

图1 DNA倍体分析、细胞形态学涂片及病理组织染色结果Fig. 1 DNA ploidy analysis， cell morphology smear， and pathological tissue staining results

表2 宫颈病变的DI 阈值及异倍体细胞数（≤2 个）、平均个数、Ki-67平均阳性细胞个数Tab. 2 DI threshold， few （≤2） and mean number of anploid cells， and mean number of Ki-67 positive cells in cervical lesions

A、B、C 为同一NILM 病例，DI 指数从大到小排列在1.615～1.250 之间，A 示DNA 倍体分析未见倍体异常，B示细胞学巴氏染色（高倍），C示组织学HE染色（高倍）；D、E、F 为同一SCC 病例，DNA DI 指数从大到小排列在4.274 与2.139 之间，D 示异倍体细胞17 个，未见多核瘤巨细胞，E 示巴氏染色细胞涂片内见多核瘤巨细胞（高倍），F示组织学HE 染色癌细胞显著异型性，呈浸润性生长（高倍）。

2.3 HPV亚型的异倍体检出率。

在HPV 低、中、高危型组异倍体的检出率分别为12.1%、57.5%、82.3%，组间具有显著的统计学差异（χ2=43.420，P<0.001），表明DNA 异倍体细胞的检出率及数量增加与HPV致瘤危险性一致（表3）。

表3 HPV亚型分组中异倍体细胞的检出率［n（%）］Tab. 3 Detection rate of anploid cells in HPV subtype groups ［n（%）］

3 讨论

研究表明，DNA-ICM 对细胞核的形态结构和DNA 含量进行定量分析，对于宫颈癌及癌前病变诊断具有较好的临床参考价值［3］，通过结合液基细胞学检测可以提高宫颈癌和癌前病变的筛查阳性率，降低漏诊率［4］，同时联合P16/Ki-67双染能有效提高宫颈癌确诊率，辅助ASC-US的分流诊断［5］。

图2 异倍体细胞平均个数、Ki-67阳性细胞平均数Fig. 2 Average number of anploid cells and Ki-67 positive cells

本实验组DNA-ICM 及HPV 筛查SIL+的灵敏度为65.9%、84.6% （χ2=34.217，P<0.001，特 异 度 为73.9%、52.2%（χ2=10.340，P= 0.006），组间均具有显著的统计学差异，作为同样的定性和/或定量客观检测指标，DNA-ICM 筛检宫颈病变的特异度明显高于HPV检测法，而灵敏度则明显低于HPV检测。

69 例NILM 的异倍体细胞的检出平均数量为0.9 个，对于其中伴中、高危HPV 感染且异倍体的检出数量增多则提示上皮细胞持续的HPV 感染和异常增殖风险，由于细胞倍体先于细胞形态变化，可有助于区别所谓的“一过性感染”，因此DNA 异倍体可作为评估具有向更高级病变转化的相对风险性预测因子。如图1A、B、C 所示无上皮内病变或恶性病变中异倍体细胞的出现除与HPV 的感染因素相关外，宫颈慢性活动性炎症所诱导的反应性增生、不成熟鳞化等也会导致倍体变化甚至异倍体细胞产生，这可能与上皮内炎细胞浸润所释放的炎症因子干扰并加速了正常增殖周期的进程。

30 例LSIL、65 例HSIL、28 例SCC 的异倍体细胞的检出平均个数分别为3.9、9.4、12.0，异倍体数量较好地反映了病变的进展状态，随着癌前病变的进展，DNA 异倍体细胞数也逐步增多以及宫颈上皮内病变完成了DNA由量变到癌的质变过程。

为提高细胞DNA 倍体检测的特异性，国内外有较多文献忽略个别（1～2 个）出现的DNA 异倍体或者把DI 值提高到≥4.5 作为细胞病理临床诊断的阳性标准。本组LSIL、HSIL、SCC 出现个别（≤2）异倍体的占比为10.1%、33.3%、26.1%、28.6%，可见在各级病变中都存在个别的异倍体，说明在HSIL甚至癌与NILM、LSIL 一样也可能存在个别而不是出现大量的异倍体的情况，因此不能单从细胞数量定义癌变风险，可能与肿瘤细胞生长周期（G0/G1→S→G2/M期）在增殖动力学上存在运行阻滞相关。

NILM、LSIL、HSIL、SCC 的DNA 异倍体DI 阈值分别为≤4、≤4、≤6、≤5，其中3 例HSIL、2 例SCC 的DI>4。因此宫颈癌筛查中可以DI>4 作为细胞病理高级别以上病变诊断指标，虽然灵敏度低，但是特异度好，同时DI>4 的HSIL 则可能存在恶性进展高风险，无论异倍体细胞数的多少或细胞学有无检出异常都要予以密切重视。

本实验组在33 例低危型HPV 样本中DNA 异倍体检出率为12.1%，在73 例中危型样本中DNA 异倍体检出率为57.5%，在62 例高危型样本中DNA 异倍体检出率为82.35%，组间存在显著性差异（χ2=43.420，P<0.001）。HPV 病毒基因整合是导致宫颈癌发生的直接原因，HPV 病毒基因E6/E7 通过感染宫颈上皮并与染色体整合，使得DNA 倍体发生异常改变，因此DNA倍体和HPV检测同样可以预示病变的发展进程及病变程度。在低危HPV也存在12.1%的DNA 异倍体检出率，说明在宫颈癌细胞诊断体系中HPV不整合也可以导致细胞的DNA倍体异常，异倍体细胞的产生不等同于致癌的高风险。而对于中、高危HPV 感染引起DNA 倍体异常，特别是异倍体细胞数量的显著增多且异倍体峰形成则可能存在致瘤高风险，无论有无细胞或组织学异常都应该加以密切随访。

Ki-67 是一种增殖细胞相关的核抗原，可以识别除G0期外的G1、S、G2、M 期的细胞。本实验统计显示NILM、LSIL、HSIL、SCC异倍体细胞的平均个数分别为0.9、3.9、9.4、12.0，Ki-67 的阳性细胞平均个数分别为3.1、10.5、88.6、255.6，两组检测组间具有显著性差异（χ2=14.680，P<0.05）。从统计数据可以看出DNA 异倍体细胞的检出数与Ki-67 阳性细胞数存在着相关性，随着病变进展，DNA 异倍体细胞数与Ki-67阳性细胞平均数均呈上升趋势。从量化数据提示尽管DNA 异倍体与Ki-67 相似，都是反映细胞的增殖活性，但异倍体细胞的出现可能反映的是细胞增殖S-G2/M 期的DNA 异常变化。如图1D、E 所示，由于DNA-ICM 对重叠和抱团细胞不能切割分析，所以相应只对游离散在的Ki-67 阳性上皮细胞作计数统计。

综上所述，细胞DNA 异倍体的产生是宫颈癌发生中的早期事件，DNA 指数（DI）反映了细胞周期中的DNA 含量和/或结构变化或异常，可以明显提高宫颈细胞学的诊断率，减少漏诊率和误诊率，辅以Ki-67 免疫组织化学提高上皮内病变的诊断和分型。DNA异倍体的数量和DI阈值对细胞学的诊断、增殖的活跃度评估及病变的进展都具有重要的应用价值。