火龙果组织培养技术研究进展

王梦龙，陈文慧，李晓诗，连丽媛，陈炜宏，张翠琳，陈兆贵，彭小群

（惠州学院 生命科学学院，广东 惠州 516007）

火龙果原产于墨西哥中部热带地区和南美洲，属于仙人掌科（Cactaceae）量天尺属多年生攀缘性肉质植物［1］。火龙果作为热带和亚热带水果，其果树生长的最适温度为25～35 ℃，在泰国、菲律宾、马来西亚和中国南部种植较为广泛，具有耐旱、耐高温、喜光耐阴和耐贫瘠的特点［2-3］。目前，红皮白肉和红皮红肉火龙果已经作为新兴的水果在中美洲、东南亚和中国进行商业栽培和大规模生产［4-5］。火龙果是一种速生型果树，在种植第2年即可开花结果，且具有多次开花结果的习性，单株全年可采6～12批次果，具有巨大的商业价值和经济价值。火龙果果实可以用于鲜食、酿酒、制作面条、冰淇淋和冻干品等［6］；火龙果的花可以用于观赏、制作花茶和煲汤食用；而火龙果的果皮由于含有大量的花青素，可用于提炼食用色素［7-8］。火龙果果实营养丰富，富含植物蛋白、水溶性膳食纤维和其他有益化合物，具有美容养颜、抗氧化和增强免疫力等多种功效［1，9］。

目前，火龙果大田生产主要采用扦插的方法进行育苗。扦插繁殖能保持母本的优良性状，不易产生遗传异型，但是扦插育苗需要高质量的插条和一定规模的采穗圃，前期投入成本大［10-11］。另外，随着火龙果种植业的不断发展，火龙果种苗的需求不断增大，从田间采集的种苗往往出现来源不明或者品种杂乱等现象，甚至携带病虫害，使火龙果的产量受到严重的损害［7，12］。火龙果种子播种能获得大量实生苗，但是直接播种存在种子发芽慢、出芽不齐、繁殖的植株性状分化较大的问题，且种子发芽所长的植株幼年期长，果实生产延迟数年［8］。快速、优质和高效的扩繁方法对火龙果商业化生产非常重要。植物组织培养可以在短时间内获得大量健康的无菌苗，且不受外界环境的影响。近年来，火龙果组织培养研究取得一定的进展，文章将从外植体的选择、外植体的消毒种类和方法、组培再生途径以及生根培养等方面对火龙果组织培养技术进行综述，以期为建立高效的火龙果组织培养提供理论依据，为火龙果的推广应用提供帮助。

1 外植体的选择

植物组织培养中外植体的选择会影响无菌体系的建立，是组培成败的关键因素之一。目前用于火龙果组织培养的外植体主要有幼嫩的茎段、子叶、胚轴和花药等。

DAHANAYAKE 和RANAWAKE［13］研究认为外植体的类型对火龙果不定芽再生能力的影响很大。在相同的培养基中，以茎为外植体诱导不定芽比以叶为外植体诱导不定芽效果好。王云山等［14］以火龙果不同长度带刺座幼嫩茎段为外植体诱导愈伤，发现以长度为3 cm幼嫩茎为外植体，愈伤组织诱导率可达100%。洪青梅等［15］研究发现以健壮无病害的红皮红肉火龙果‘金都一号’近成熟茎段为外植体，愈伤诱导率为80%。

另外，黄红梅等［16］利用红皮白肉火龙果种子发苗，利用幼苗的茎段、子叶和胚轴为外植体进行愈伤组织诱导，发现胚轴在所有供试的培养基中均没有形成愈伤组织；茎段诱导的愈伤组织后期生长缓慢甚至停止生长，不能分化出不定芽；而子叶诱导的愈伤组织量大、长势好，且能分化出不定芽和生长成植株，因此初步认为子叶是红皮白肉火龙果诱导愈伤组织的最佳外植体。彭思维［17］用红皮红肉火龙果‘紫红龙’种子无菌发苗长出幼嫩植株，分别以幼嫩植株的茎段、子叶和胚轴为外植体诱导愈伤组织。研究发现子叶诱导的愈伤组织褐化严重，不能成功分化；而茎段和胚轴诱导的愈伤组织能成功分化出不定芽，但是芽苗呈黄绿色、细弱，不利于生根培养；只有以成熟‘紫红龙’火龙果植株幼嫩茎段诱导培养出新茎段为外植体进行愈伤组织诱导的效率较高，分化能力强，且最终能获得火龙果再生植株。

范建新［18］以红皮紫红肉‘紫红龙’火龙果花药为外植体诱导愈伤组织，经过4 ℃低温预处理48 h 后愈伤组织诱导率可达32.8%。以上研究说明不同火龙果品种可用于诱导愈伤组织的外植体不同。此外，不同外植体的内源激素不同，而内源激素对愈伤组织的诱导率影响较大。范建新［18］研究发现‘紫红龙’火龙果的茎段之所以易于诱导愈伤组织，与其茎段内源IAA和ZT含量较高密切相关。此外，有研究发现添加高浓度TDZ 有利于‘紫红龙’茎段愈伤组织的形成，但不利于不定芽的再生［19］。

2 外植体的消毒种类和方法

选定外植体后，需要对外植体进行消毒处理。外植体的消毒方式与火龙果组织培养的成活率密切相关，消毒时间过长会导致外植体产生毒害，而消毒时间过短会使得外植体表面灭菌不彻底而导致污染。合适的消毒剂既需要将表面的细菌微生物彻底杀死，又不能对外植体造成毒害。目前组培上常用体积分数为75%酒精［7］、w=0.1%升汞［19-20］或者低质量分数的次氯酸钠［8］对外植体进行消毒。根据不同外植体的情况需选择不同的消毒方式和消毒时间进行处理。

目前的研究发现，对火龙果茎段的消毒可采用75%酒精消毒30～60 s，用无菌蒸馏水冲洗3次，然后用w=0.1%升汞消毒8～15 min，最后用无菌蒸馏水冲洗3～5 次［7，21］。王云山等［14］以生长健壮母茎的新生茎段为外植体，采用w=0.1%的升汞消毒处理15 min后外植体污染率最低，但大部分外植体材料的刺座及茎棱会出现褐化和坏死现象，说明用w=0.1%的升汞消毒15 min时间过长，会导致茎段组织细胞坏死。有研究发现储存在10 ℃条件下，3 个月的火龙果种子其活力显著下降，而刚从果肉中分离的种子更适合用于生产外植体［13］。火龙果种子的消毒需要将种子清洗干净，用w=0.1%升汞消毒4 min再用无菌蒸馏水冲洗3～5次，或者用w=3%次氯酸钠消毒12 min后再用无菌蒸馏水冲洗3～5 次［17］。DAHANAYAKE 和 RANAWAKE［13］则通过将种子单独浸泡过夜后先用70%酒精消毒2 min，再在含有体积分数为6%吐温20 和质量分数为1%的次氯酸钠中浸泡10 min 进行表面消毒，最后用无菌水洗数次。细菌污染以及对次氯酸钠消毒的高组织敏感性是目前仙人掌科植物组培常见的问题。有研究认为在消毒过程中可使用内吸性杀菌剂与广谱防腐剂相结合的方法［3］。TRIVELLINI 等［3］研究发现添加广谱抗生素头孢噻肟至培养基中有助于去除内源性污染，而且可能对连续诱导阶段的外植体增殖产生有益的影响。另外有研究报道可通过添加吐温20 以及抽真空的方式增强消毒效果［3，13］。

3 组织培养再生途径

目前火龙果组织培养体系的建立主要通过直接器官发生和间接器官发生2种方式。直接器官发生是指外植体不经过愈伤组织阶段，直接分化不定芽，生根成苗。间接器官发生是指外植体脱分化形成愈伤组织，愈伤组织再分化形成不定芽，继而生根成苗。直接器官发生周期短，且不易发生变异，是火龙果组织培养研究常用的方法。

3.1 直接器官发生途径

在火龙果组织培养过程中，植物生长调节剂虽然用量少，但是对外植体直接器官发生起着至关重要的作用。在组培中，TDZ、ZT、6-BA和2，4-D常用于不定芽诱导再生［7］。

HUA等［7］研究发现火龙果外植体对TDZ的敏感性比对 ZT，6-BA 和 2，4-D 高。低至 0.11 μmol/L 的 TDZ可诱导外植体近端基部形成绿色致密愈伤组织，从而显著抑制已经形成的枝条生长。增加6-BA、TDZ 或ZT 的浓度，可使每个外植体枝条数显著增加，但枝条高度会显著降低。当 2，4-D 浓度小于 0.45 μmol/L 时有利于枝条繁殖，而较高浓度（≥0.45 μmol/L）则会导致产生易碎的愈伤组织。

火龙果不定芽的形成受细胞分裂素和生长素相互作用调控。MOHAMED-YASSEEN［22］研究报道火龙果不定芽增殖最佳的培养基为含有0.5 mmol/L TDZ 和0.5 mmol/L NAA的MS培养基；FAN等［21］发现火龙果不定芽诱导最佳培养基是具有2.0 mmol/L 6-BA 和0.5 mmol/L NAA 的 MS 培养基；DAHANAYAKE 和 RANAWAKE［13］研究发现以幼茎为外植体，在MS+2.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA培养基中培养4周后可产生愈伤组织，随后3周产生多个芽原基，并进一步分化为不定芽；而HUA等［7］研究发现每个外植体的最佳芽数是在培养基中添加13.68 μmol/L ZT和2.46 μmol/L IBA获得的。

在火龙果不定芽诱导中，细胞分裂素6-BA具有重要的调控作用［13，21］。彭绿春等［23］研究发现用保留小刺和绒毛的茎段诱导不定芽，不定芽诱导的最适培养基为 MS+2～4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 或者为 MS+0.4～0.6 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA；而不定芽增殖最适培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，增殖系数可达6.4。牟海飞等［12］研究发现，以红皮红肉火龙果‘桂红龙1号’茎段为外植体，在培养基中添加4 mg/L 6-BA，不定芽诱导效率最高。但是随着6-BA 质量浓度的增加，虽然不定芽诱导增殖倍数也增高，但是会出现玻璃化的现象。洪青梅等［15］以‘金都1号’成熟茎为外植体诱导不定芽，发现不定芽诱导最适培养基为MS+4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，不定芽诱导率可达80%。李清香和吴红英［24］研究发现以‘金都1号’新萌芽茎段诱导不定芽，不定芽诱导最适合培养基中也是只需含少量NAA（0.1 mg/L），但是6-BA的质量浓度需要达到8 mg/L。何小帆等［25］以红心火龙果幼嫩茎段为外植体诱导不定芽，发现不定芽诱导最佳培养基为MS+3 mg/L 6-BA+1.5 mg/L NAA，诱导率可达87.03%。邓仁菊等［26］以‘紫红龙’成年火龙果1年生植株茎段为外植体，研究不同生长调节剂及配比对茎段不定芽诱导的影响，发现‘紫红龙’火龙果不定芽诱导培养基为MS+2 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA，不定芽增殖系数最高的培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+500 mg/L 胰蛋白胨。NIE 等［2］研究发现 4 个火龙果品种‘Zihonglong’‘Honglongguo’‘B4’和‘ZY’均可在含有 0.1 mmol/L NAA 和2 mmol/L 6-BA 的MS 培养基中诱导不定芽。由于在细胞分裂素中，6-BA 的价格是最便宜的，并且能进行高压灭菌。考虑到操作的便利性和成本，火龙果不定芽的诱导可优先在培养基中使用6-BA。

3.2 间接器官发生途径

通过间接器官发生途径建立火龙果的再生体系可对火龙果进行遗传转化研究，改善火龙果品质，提高种苗质量。黄红梅等［16］研究发现以火龙果子叶为外植体诱导愈伤组织，最适培养基为1/2 MS+2 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA，以茎段为外植体诱导愈伤组织的最佳培养基为1/2 MS+2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA。彭思维等［19］以红皮红肉火龙果‘紫红龙’幼嫩茎段为外植体诱导愈伤组织，发现最佳诱导愈伤组织的培养基为MS+1 mg/L 2，4-D+0.4 mg/L TDZ+0.5 mg/L NAA。高质量浓度的TDZ 有利于茎段愈伤组织形成，但是不利于不定芽的再生。李羽佳等［27］以黄皮白肉火龙果种子萌发的茎段为外植体，发现最适合诱导的愈伤组织的培养基为1/2 MS+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA。

目前，关于火龙果遗传转化体系研究的报道极少。范建新［18］以红皮红肉火龙果‘紫红龙’组培苗的幼嫩茎段（变态叶）为受体，通过农杆菌介导将LTP（Liquid transfer protein）基因导入火龙果柔嫩茎段获得25株转LTP基因的再生植株，转化效率可达37.5%，且转基因植株抗寒性显著提高。但是以‘紫红龙’火龙果花药培养获得的胚性愈伤组织为受体，通过农杆菌介导的方式转化抗寒基因LTP，虽然能获得抗性愈伤，但是不能成功分化出不定芽。彭思维［17］虽然能以‘紫红龙’火龙果的茎段为外植体诱导愈伤组织并分化获得组培苗，但是并没有对茎段的愈伤组织进行遗传转化实验。

4 生根培养与移栽

火龙果生根的基本培养基一般为MS或者是1/2 MS。NIE 等［2］通过在1/2 MS 培养基中添加 0.1 mmol/L NAA对于 4 个火龙果品种‘Zihonglong’‘Honglongguo’‘B4’和‘ZY’的生根均有促进作用。DAHANAYAKE 和RANAWAKE［13］研究发现火龙果生根的最佳培养基为MS+0.01 mg/L NAA。

有研究发现在基础培养基中添加一定浓度的活性炭（AC）有利于促进根的生长，而添加一定量的矮壮素（CCC）有利于苗的粗壮［19，26］。彭思维等［19］诱导火龙果茎段形成愈伤组织后对从生芽进行生根培养，发现在含有200 mg/L AC以及0.5 mg/L CCC的MS培养基中从生芽的生根率可达97%，平均根数为7.0，平均根长可达10.3 cm。邓仁菊等［26］以火龙果成年茎段诱导不定芽进行生根扩繁，发现最佳的生根培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1～0.2 mg/L NAA+0.5～1.0 mg/L CCC+0.03%～0.05%AC，不定芽的生根率可达98%。值得注意的是，AC的吸附能力很强，但是其吸附不具选择性，除了可以吸附培养基中的有毒物质外，也会吸附营养物质，对组培苗产生影响，因此在实际操作过程中应根据材料的状况摸索出合适的浓度。

有研究认为低无机盐浓度有利于根系生长，黄彩枝［28］以海南红心火龙果为研究对象，发现其最佳的生根培养基为1/2 MS+1 mg/L IBA+0.8 mg/L ABT，生根率可达100%。黄红梅等［16］研究发现当火龙果在生根培养基1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA中培养，平均根数可达5.14，根长4 cm。值得一提的是，FAN等［21］研究发现：与琼脂相比，珍珠岩促进了体外芽的根诱导和新根的形成。将发育良好的枝条转移到含有1 μmol/L NAA的1/2MS液体培养基中，用珍珠岩代替琼脂生根，生根率达100%；在3周内可从每个芽中获得6～10个白根，每根根长达5～8 cm。成苗后的火龙果移栽较为方便，将生根良好的火龙果苗去除琼脂，用自来水洗净之后可置于v（土壤）∶v（珍珠岩）=1∶1 的混合物中，在生长室下盖上塑料7～10 d，随后移至温室大棚生长或者转移到含有v（土壤）∶v（沙子珍珠岩）=1∶1的混合物的盆中以适应环境即可［3，21］。

5 讨论及展望

火龙果组织培养体系的建立能在短时间内获得大量优质的无菌苗，可以满足日益增大的市场需求，但是也存在一些问题：一是火龙果品种繁多，不同研究学者针对不同品种或者同一品种不同外植体的火龙果进行研究得出的组织培养各阶段最佳的生长条件和最适的植物生长调节剂种类以及配比均有差异，这可能与不同品种的材料以及同一品种不同外植体的内源激素含量不同有关，也可能与不同品种的不同的遗传背景有关［7-8］，因此，实际操作需要通过实验筛选出最合适的条件。二是关于火龙果的组织培养研究大部分集中于直接器官发生途径，对于通过外植体诱导愈伤组织，诱导不定芽从而生根成苗的研究报道极少。目前，火龙果的遗传转化体系尚未成熟，所以在火龙果的遗传改良和种质资源保存等方面的研究较少。例如由真菌Neoscytalidium dimidiatum引起的溃疡病是火龙果行业最具破坏性的疾病之一，难以像模式植物一样通过转基因的方法研究火龙果的基因功能对其进行改良育种［29］；另外，对火龙果调控盐胁迫相关的基因功能研究只能通过异源表达至其他模式植物中进行研究，火龙果的抗逆品种的培育还任重道远［30］。近年来科研工作者关注到火龙果中参与非生物胁迫和抗氧化酶相关基因的功能［1-2］，通过遗传转化手段将相关基因导入火龙果植株进行研究将对火龙果的保鲜具有一定的指导意义。随着火龙果产业的不断发展，利用组织培养技术对火龙果进行遗传改良获得品质优良、抗性好的火龙果种质将是未来的研究热点之一。